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目的:
采用免疫组织化学方法,检测KiSS-1与MMP-9在胃癌中的表达,并分析两者与胃癌临床病理因素以及患者临床预后之间的关系,探讨其在胃癌发生和转移过程中的作用。
材料与方法:
临床病理资料:收集中国医科大学附属第一医院肿瘤外科手术切除胃癌标本164例,其中同时收集配对164例正常胃粘膜,42例慢性萎缩性胃炎,93例肠上皮化生以及15例异型增生。标本离体后尽快取材,10％甲醛固定24 h,取材组织厚4 mm,常规组织处理、石蜡包埋,制成目标蜡块,做4μm组织切片,用于目标组织定位。采用组织芯片制作仪将胃癌及其癌前病变以及配对正常胃粘膜等目标组织构建于组织芯片蜡块中,行4μm连续切片,备用。
免疫组化染色与结果判定:用PV9000法检测KiSS-1及MMP-9的表达情况。PV9000试剂盒购自北京中杉生物公司。KiSS-1鼠抗人单克隆抗体(工作浓度1:300)购自美国.Abnova公司,MMP-9鼠抗人单克隆抗体(工作浓度:1:100)购自美国Santa Cruz公司。采用柠檬酸修复液(pH6.0)高压修复抗原,PBS替代一抗做阴性对照。结果判定:KiSS-1、MMP-9免疫组化染色采用DAB显色系统显色,KiSS-1、MMP-9蛋白阳性为棕黄色颗粒定位于细胞浆和/或细胞核。免疫组化结果由两位观察者采用盲法每个病例随机选择2个高倍视野,计数200个细胞,按照阳性细胞数占同类细胞数的比例,进行等级划分。结果采用半定量计分方法,根据细胞染色强度(A)和染色细胞所占的比例(B)两者乘积来判定。即:(A):染色强度按下列标准评定记分:0分为无色;1分为浅黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色(B):染色的阳性细胞占比例按下列标准评定记分:0分为阴性细胞或弱阳性细胞＜5％,1分为阳性细胞占5～10％,2分为阳性细胞占11％～50％,3分为阳性细胞51％～75％,4分为阳性细胞＞75％。两种评分相乘(A×B),将结果分为:0分为阴性(-);1～4分为弱阳性(+);5～8分为中度阳性(++);9～12分为强阳性(+++)。将正常胃粘膜中KiSS-1的阳性表达水平作为基准,把胃癌组织中KiSS-1的表达情况分为四组:全阴性组A,正常胃粘膜和胃癌组织中表达均为阴性:无变化组B,KiSS-1在胃癌组织和正常胃粘膜中表达无明显差异;下调组C,KiSS-1在胃癌组织中的表达低于配对的正常胃粘膜;上调组D,KiSS-1在胃癌组织中的表达高于配对的正常胃粘膜(评分标准相差一个等级表示存在显著差异)。
结果:
胃癌中KiSS-1的阳性表达率(67.90％,110/162)显著低于正常粘膜(83.59％,136/162)、慢性萎缩性胃炎(90.04％,38/42)和肠上皮化生(83.87％,78/93)中的阳性率,P＜0.05;异型增生(66.67％,10/15)与胃癌中KiSS-1的表达无明显差异。胃癌组织中MMP-9的阳性表达率(78.40％,127/162)显著高于正常粘膜(31.48％,51/162)和慢性萎缩性胃炎(52.38％,22/42)(P＜0.05)。慢性萎缩性胃炎(52.38％,22/42)、肠上皮化生(68.62％,64/93)中MMP-9表达也显著高于正常胃粘膜(P＜0.05)。
KiSS-1的表达在性别、年龄、管状腺癌分化程度、浸润深度和淋巴结转移中,四组未见明显差异。全阴性组(45.46％,10/22)中BorrmannⅠ型和BorrmannⅡ型的比例高于其他三组(12.14％,17/140),差异有统计学意义(P=0.001);上调组发生(34.6％,9/26)远处脏器转移的比率高于其他组(21.3％,29/136),但差异无统计学意义(P=0.143);发生肝转移的比例中,上调组(19.23％,5/26)明显高于其他组(5.14％,7/136),差异具有统计学意义(P=0.026)。MMP-9的表达与年龄、性别、Borrmann分型、淋巴结转移、浸润深度、远处转移均未见明显相关(P＞0.05)。肠型胃癌(90.48％,38/42)中的阳性表达显著高于弥漫型胃癌(74.11％,83/112)(P＜0.05)。
胃癌中KiSS-1表达各分组中MMP-9表达差异无统计学意义(P＞0.05)。
通过60个月的随访,146名可评价的患者之中有76名仍然生存,70名死亡。5年总生存率为47.9％,平均生存时间为38.85 months。KiSS-1表达全阴性组,无变化组,下调组和上调组患者五年生存率分别为35.3％(6/17)、61.1％(33/54)、50％(25/50)和48％(12/25),平均生存时间分别为36.3±6.0 months、36.0±2.7 months、32.2±3.5 months和23.6±2.3 months,差异无统计学意义(P=0.554,log-rank检验)。上调组与与全阴性组,无变化组和下调组相比,患者平均生存时间较短,但差异无统计学意义(P＞0.05)。MMP-9阴性和阳性的患者五年生存率分别为43.8％和54.4％,平均生存时间分别为34.6±4.6 months和34.1±2.0months,无明显差异(P=0.832,log-rank检验)。强阳性组(15.2±4.8 months)和其他组(35.0±2.9 months)相比,平均生存时间较短,差异有统计学意义(P=0.032,log-rank检验)。
结论:
与正常胃粘膜相比,胃癌组织中存在着KiSS-1下调和MMP-9表达的上调,可能在胃癌发生过程中发挥着重要作用。本研究中,胃癌中KiSS-1表达各分组中MMP-9的表达未见明显差异。KiSS-1上调组肝转移发生率较高。MMP-9强阳性表达与不良预后相关。