大鼠脑中催产素受体cDNA的克隆和在大肠杆菌与CHO细胞内的表达

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催产素(oxytocin,OT),一种神经肽,在外周组织和中枢神经系统内(CNS)都发挥着重要的生理作用。在外周,OT主要参与分娩、泌乳和水钠代谢的调节;在脑内,OT与母性行为和生殖行为、学习记忆、镇痛等生理功能有关。有研究发现,早老性痴呆症病人,其海马内OT浓度的增加非常显著。近来的研究还发现,OT可抑制阿片类药物的耐受和依赖。这提示OT在脑内参与了很多生理和病理生理过程。 在外周组织,OT主要通过与其受体(oxytocin receptor,OTR)结合从而启动多种信号转导途径而发挥作用。例如,OT与子宫平滑肌细胞上的OTR结合后,通过Gq-PLC信号转导途径使细胞内Ca2+浓度升高而导致平滑肌收缩。但CNS内OT-OTR的作用机制仍不清楚,因此很有必要对CNS内OTR的生理作用及其信号转导机制进行研究,这有利于揭示CNS内OT的多种生理功能;阐明OTR在一些疾病如痴呆症,药物成瘾的发病机制中起到的作 中文摘要 用。 1992年,Kimura首先从人子宫肌层的 cDNA文库中利用表达性筛选方 法克隆得到了**R的C DNDNA,全长约4.Ikb,其中编码区为11 67 hp,编码38吕 个氨基酸。随后,数种哺乳动物的OTR。DNA基因相继被克隆和解析,其组 织来源均为于宫和其它外周组织、细胞。虽然,目前的克隆结果表明只有一 种OTR;但有研究提示在中枢神经系统内可能存在OTR的另外亚型,OT与 其结合后可能发挥与外周不同的作用。从脑中克隆OTR cDNA全长的研究 从未见报道,1995年,Adan R.A.H.利用RT平CR从大鼠脑内克隆了第五跨 腆和第六跨膜域之间氨基酸的编码序列,约290hp,与于宫的编码序列完全 一样。但山于在OTR基因中,这部分序列位于第三个内含子以前,因此并 不能挑除剪按内含子时导致的异变体,从而产生0*R的亚型。所以,克隆 脑中 OTR CDNA编码区全长是非常必要的。 我们采用RT-p*R的方法从大鼠外周和中枢神经组织中同时克隆0*R 的cDNA编码区全长,然后对这两个序列进行比较,以探讨脑内OTR的 。DNA编码区是否与外周组织不同。而获得OTR。DNA为从分子水平研究脑 内OTR的结构、功能和临床意义奠定了基础。 关于OTR在大肠杆菌内的表达,国内外尚未见报道。在克隆得到OTR 的CDNA后,我们尝试在大肠杆菌中进行OTR全长和不同片段的表达,以 获得大量的重组OTR蛋白。我们利用pET毛8-a载体构建了OTR全长与His tag融合蛋白原核表达载体:pET毛8*-OTR;利用pGEX叶TI载体构建了 OTR不同结构域与 GST(Glutathione S-Transferase,谷眺甘肽七转移酶)的融 合蛋白表达载体:pGEX4T上-OTRN 40,pGEX*T上-OT洲40 和 pGEX斗ToDTRC55。然后在大肠杆菌表达株 BLZI内进行了这些重组质粒 在 的诱导表达研究。 I 2 中文摘典 CHO(Chin hamster ovary)细胞,中国仓鼠卵巢细胞,足目前F)【究蛋自 质冥核表达和信号转导等应用最多的细胞之一。因此,本工作的另一个目的 就是利用细胞培养和真核转染技术,建立一个稳定表达OTR的真核细胞株, 即 CHO.OTR,CHO-OTR是体外研究OTR信号转导杉制的良好模型。 此外,我们还分别利用核酸疫苗技术和常规免疫技术制备了OTR的抗 血清。免疫印迹证明,利用 pCDNA3.IOTR和 OTR-GST融合蛋白免疫 BALB儿 ,J’鼠得到的抗血清均与子宫中OTR发生免授反应,其中 pCDNA3.IOTR的抗体特异性股强。 本工作的主要结果如下:互 1.成功地从分yk后大鼠的脑和子宫组织中,利用 RTICR (方法克隆得到 0*R的C**A编码区全序列:应用0*A序列比较软件*陀川屯n对脑和 子宫中的OTR的。DNA编码区全序列进行比较,发现来源于脑和子宫组 织的 OTR CDNA编码区序列是完全一致的,且大小均为门 67hp。 2.将OTR CDNA编码区全长亚克隆至pET-28·口载体、将OTR CDNA编 码区 5’端420hp、5’9 120 hp和3’端 168hp 的片段分别亚克隆至pGEX-4T-3 载体,然后将这些重组质粒在大肠杆菌 BLZI内进行表达,发现只有 5’端 120 hp,即编码 OTR氨基端胞外域的基因片段能够在大肠杆菌内高效表 达。 3.优化诱导表达的条件,得到大量水溶性的OTR氨基端胞外域与GST的 触合蛋白(
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