第一部分阿尔茨海默病小鼠模型APP/PS1双转基因小鼠中线粒体DNA甲基化的研究[研究背景]阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性记忆力下降和其他认知功能减退为特征的慢性神经退行性疾病,是导致痴呆的最常见的原因。然而,AD的病因和发病机制到目前为止尚不完全明确,研究表明,线粒体功能障碍在AD发病中起重要作用。最近研究表明,线粒体基因存在表观遗传学改变,在许多线粒体功能障碍相关的疾病中发挥重要作用,因此,有学者提出,线粒体表观遗传学可能是导致AD的一种潜在的发病机制。表观遗传学是指在有丝分裂和/或减数分裂中可遗传的基因功能的改变,这些变化不能用DNA序列改变来解释。主要的表观遗传学修饰模式包括DNA甲基化和羟甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA(ncRNA)等。其中,DNA甲基化在调控基因表达方面发挥重要作用。DNA甲基化与许多疾病密切相关,其中包括AD。过去十几年,关于AD中DNA甲基化的研究多集中在细胞核DNA。与核DNA相比较而言,线粒体DNA(mtDNA)甲基化是一个相对较新的领域。尽管缺乏直接证据,但mtDNA甲基化很可能通过调节mtDNA的复制和线粒体基因表达水平在许多病理生理过程中发挥作用。最近研究发现,mtDNA甲基化与年龄、环境因素和许多疾病存在相关性,而在AD中的相关研究极少,到目前为止,国内外仅有两项相关研究,且多集中在线粒体D环区(D-loop),其他线粒体基因研究较少。MtDNA甲基化与AD的关系尚不明确。因此需要进一步的研究来明确AD中的mtDNA甲基化的异常改变及探讨mtDNA甲基化参与AD发病的可能机制,为AD提供新的治疗思路和治疗靶点。[研究目的]本研究的目的是利用经典的AD小鼠模型——淀粉样前体蛋白/早老素1(APP/PS1)双转基因小鼠,初步探讨mtDNA甲基化与AD的关系。本研究利用目前DNA甲基化检测的金标准——焦磷酸盐测序的方法,检测mtDNA四个不同基因的甲基化水平,包括非编码D环区及三个编码区基因,即12S rRNA基因、细胞色素b(Cytb)基因和细胞色素氧化酶Ⅱ(COX Ⅱ)基因,进而明确mtDNA是否存在甲基化,以及AD中mtDNA是否发生异常甲基化。本研究拟同时检测线粒体超微结构、mtDNA拷贝数和线粒体基因表达水平,目的是寻找其与mtDNA甲基化的关系,探讨mtDNA甲基化参与AD发病的可能机制,为寻找AD的治疗靶点提供新的方向。[研究方法]1.动物:实验组为9月龄的雄性APP/PS1双转基因小鼠,对照组为同月龄的雄性C57BL/6J小鼠,取小鼠海马组织。2.用透射电子显微镜观察小鼠海马CA1区的超微结构。3.我们取实验组和对照组各10只小鼠的海马提取DNA,亚硫酸氢钠修饰,设计引物并进行聚合酶链式反应(PCR),用焦磷酸盐测序方法检测mtDNA甲基化水平,包括D环区、12S rRNA基因、Cytb基因和COX Ⅱ基因的多个CpG位点的甲基化状态。4.用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测小鼠海马mtDNA拷贝数,包括12S rRNA基因、Cytb基因和COX Ⅱ基因的拷贝数,以核18S rRNA基因为内参基因计算相对拷贝数。5.我们取实验组和对照组各10只小鼠的海马组织提取RNA,逆转录合成cDNA,qRT-PCR方法检测线粒体基因表达,包括12S rRNA基因、Cyt b和COXⅡ三个线粒体基因的表达水平,以β-actin基因作为内参。使用2-△△Ct法计算得出mtDNA三个基因的相对表达水平。[研究结果]1.透射电子显微镜观察到实验组APP/PS1双转基因小鼠的海马CA1区线粒体超微结构发生异常改变,可见大量损伤、退化的线粒体,主要表现为线粒体肿胀、结构不清、崤断裂,而对照组C57BL/6J小鼠海马CA1区的线粒体形态基本正常,结构完整,嵴清晰。2.焦磷酸盐测序方法检测mtDNA甲基化结果显示,实验组及对照组小鼠海马的mtDNA均发生甲基化,所有线粒体基因不同CpG位点的平均甲基化程度均较低,不超过7%。MtDNA甲基化改变在总体mtDNA中只占很小的一部分。AD小鼠的海马中,D环区多个CpG位点的甲基化水平较对照组明显减低,相反,12S rRNA基因、Cyt b基因和COX Ⅱ基因多个CpG位点的甲基化水平均较对照组明显升高。这是迄今为止,首次在AD中发现线粒体12S rRNA基因、Cyt b基因和COX Ⅱ基因存在异常高甲基化,也是首次在9月龄的AD小鼠中发现线粒体D环区异常低甲基化,具有极高的创新性。3.qRT-PCR方法检测小鼠海马的mtDNA相对拷贝数结果显示,AD小鼠的海马中,线粒体12S rRNA基因、Cyt b基因和COX Ⅱ基因的相对拷贝数较对照组均显著减少。4.qRT-PCR方法检测小鼠海马的线粒体基因表达水平,结果显示,AD小鼠的海马中,线粒体12S rRNA基因、Cyt b基因和COX Ⅱ基因的表达水平较对照组均明显降低。[主要结论]1.MtDNA存在甲基化修饰,但所有线粒体基因甲袪化程度均较低。AD小鼠海马的线粒体不同基因发生不同的甲基化异常改变,线粒体非编码D环区甲基化水平减低,且本实验首次发现AD中12S rRNA基因、Cytb和COX Ⅱ三个线粒体编码区基因甲基化水平均明显升高。我们推测mtDNA甲基化可能在AD发病中起重要作用。2.AD小鼠存在线粒体形态异常,mtDNA多个基因相对拷贝数及表达水平均下降,提示线粒体生物合成下降、线粒体功能障碍。3.我们推测mtDNA甲基化作为一种重要的表观遗传学调控模式,可能通过影响mtDNA拷贝数和调控线粒体基因表达参与AD发病,但这需要进一步研究证实。第二部分阿尔茨海默病患者外周血线粒体DNA甲基化的研究[研究背景]近年来,关于AD与DNA甲基化的相关性有许多研究,包括全基因组和某些特殊基因的甲基化,但结果并不完全一致。也有一些研究检测了 AD患者外周血中DNA甲基化水平,发现AD患者外周血中全基因组和多个基因的甲基化水平发生异常改变,可以作为AD诊断的生物学标志物。此外,外周血多个基因的异常甲基化还可以作为预测遗忘型轻度认知障碍(aMCI)向AD转化的潜在表观生物学标志物。但是目前相关研究多集中在细胞核DNA甲基化。与核DNA相比较,mtDNA甲基化是一个相对较新的领域。越来越多证据表明,mtDNA也可以发生甲基化改变。线粒体功能障碍是AD的一个重要特征,有学者提出AD的线粒体功能障碍可以通过mtDNA异常甲基化来部分解释。但在AD中,mtDNA甲基化的研究才刚刚起步,目前仅有两项相关研究。其中一项研究表明,晚发型AD(LOAD)患者外周血中线粒体D环区甲基化程度显著降低,研究者认为mtDNA甲基化与AD的关系值得进一步探讨。但是,目前关于AD患者外周血中线粒体其他基因的甲基化改变尚无相关研究。因此,我们设计了第二部分实验研究。[研究目的]本研究的目的是收集AD患者及正常对照者的外周血,采用焦磷酸盐测序方法检测线粒体D环区及MTRNR1(mitochondrially encoded 12S rRNA)基因甲基化程度,明确AD患者中mtDNA是否发生异常甲基化,进一步探讨mtDNA甲基化与认知功能的相关性,是否可以作为AD诊断的生物学标志物。[研究方法]1.研究对象:入选AD组24例和正常对照组28例,收集所有受试者的临床资料,完善相关量表评估。2.所有受试者抽取空腹静脉血,提取DNA,亚硫酸盐转化,焦磷酸盐测序方法检测mtDNA甲基化水平,包括D环区、MTRNR1基因的多个CpG位点的甲基化水平。3.采用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析,对两组间有显著性差异的指标,采用Spearman相关分析的方法分析其与认知功能的相关性,进一步绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析是否可作为AD诊断的生物学标志物。[研究结果]1.AD组和正常对照组在性别、年龄、受教育年限方面无显著统计学差异(P>0.05),具有可比性。MMSE评分在两组之间存在显著性差异(P<0.01)。2.焦磷酸盐测序方法检测外周血中mtDNA甲基化水平,结果显示,线粒体D环区及MTRNR1基因不同CpG位点的平均甲基化程度均较低,不超过8%。在AD患者外周血中,线粒体D环区多个CpG位点的甲基化水平显著降低,而MTRNR1基因多个CpG位点的甲基化程度均较对照组增加。这是迄今为止,首次在AD患者外周血中发现,线粒体MTRNR1基因发生高甲基化改变,具有极高的创新性。3.Spearman相关分析表明,AD患者外周血D环区测序片段的第1个CpG位点(人mtDNA序列第61位核苷酸)的甲基化水平降低与认知功能减退存在正向相关(r=0.947,P<0.01)。而线粒体D环区及MTRNR1基因的其他CpG位点甲基化水平与MMSE评分之间无相关性。4.ROC曲线分析显示外周血线粒体D环区测序片段的第1、2个CpG位点甲基化对AD诊断的准确度较低,而D环区测序片段的第3、5个CpG位点和MTRNR1基因测序片段的第1、5个CpG位点甲基化对AD都具有一定的诊断性能。其中以MTRNR1基因测序片段的第1个CpG位点(mtDNA序列第886位的核苷酸)最佳,曲线下面积(AUC)及95%可信区间(CI)为0.869(95%CI:0.770-0.968),以2.50%为截值,此时敏感度为83.3%,特异性为78.6%。[主要结论]1.人外周血线粒体D环区及MTRNR1基因的不同CpG位点的平均甲基化程度均较低。在AD患者外周血中,D环区低甲基化,而MTRNR1基因甲基化水平升高。我们推测mtDNA甲基化可能与AD发病相关。2.AD患者外周血D环区测序片段的第1个CpG位点(人mtDNA序列第61位核苷酸)的甲基化水平降低与认知功能减退存在正向相关。3.外周血D环区和MTRNR1基因的共4个CpG位点的甲基化水平对AD有一定的诊断性能,尤其以MTRNR1基因测序片段的第1个CpG位点(人mtDNA序列第886位的核苷酸)最佳,有可能成为AD诊断的一种潜在的、无创的生物学标志物。