目的：　　中药引起的肝损伤（herb-induced liver injury，HILI）报道日益增加，已成为危害公众健康、制约中医药发展的不容忽视的问题。山豆根在临床应用已超过千年，其毒副作用也时见报道，其中包括山豆根超剂量服用可引起肝损害。因此其毒副作用究竟是药物自身毒性，还是临床不合理用药造成的？是否能够通过早期评价指标减少或降低毒副作用的发生？本课题采用中药化学、分子生物学、生物化学、细胞生物学以及毒理学和病理学等理论支持和技术方法，应用模式生物斑马鱼模型快速评价山豆根潜在肝脏毒性，应用基于iTRAQ-LCMS/MS的蛋白质组学技术，对山豆根大剂量给药下的大鼠肝组织进行差异表达蛋白的检测，并通过GO分析和KEGG通路研究，寻找山豆根参与肝细胞损伤生物学过程改变的可能途径，并在大鼠、人正常肝细胞L-02等体内体外模型上深入探讨山豆根及其主要活性成分之一苦参碱的毒性作用机制，进一步明确山豆根致肝脏损伤可能的物质基础，寻找和发现能够早期预警山豆根致肝损伤的潜在生物标志物，使山豆根更好的应用于临床，在充分发挥其疗效的同时尽可能避免其毒性风险。　　方法：　　本课题分为五个部分进行研究:　　1.制备质量稳定可控的山豆根浸膏粉　　运用正交设计优化的工艺进行煎煮，浓缩干燥后得到浸膏粉。利用高效液相色谱技术测定浸膏粉中苦参碱及氧化苦参碱含量，并对不同批次间的色谱图进行比较，得到质量稳定及可控的浸膏粉;　　2.山豆根对斑马鱼及大鼠潜在肝毒性的探讨研究　　山豆根对斑马鱼肝脏毒性检测实验浓度设置为LC10、MNLC、1/3 MNLC及1/9MNLC，同时设置空白对照组，每个浓度均处理30尾斑马鱼。评价指标包括:肝变性（肝坏死）、肝肿大/肝萎缩以及卵黄吸收延迟。实验处理结束后，每组选取30尾斑马鱼在显微镜下进行观察统计并拍照。利用软件分析肝脏面积、肝脏透明度和卵黄面积，用SPSS18.0对数据进行统计分析。　　山豆根0.5g/kg、1.5g/kg、4.5g/kg及苦参碱200mg/kg重复灌胃给予大鼠28天，对常用指标进行检测，包括:①动物给药期间的一般表现;②肝功能检测:全自动生化仪测定ALT，AST，ALP，TBiL，TBA，GLDH;③肝脏病理学检查，包括人体解剖、组织病理学检查。④对4.Sg/kg及苦参碱给药7天的大鼠肝脏采用TUNEL法对肝细胞凋亡进行原位检测。对不同时间点考察时间－效应关系，剂量－效应关系，确定其对大鼠的肝损伤表现。　　3.基于iTRAQ技术的大鼠肝脏组织蛋白质组学研究　　在上述大鼠重复给药模型中，取给药7天的空白对照组及给药组（山豆根4.5g/kg组）的肝脏组织，采用SDS-PAGE电泳技术对肝脏组织提取物进行分离，经过酶解和肽段定量、肽段iTRAQ标记，SCX分级及质谱分析，用软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4进行质谱鉴定及定量分析。对蛋白质鉴定结果以PeptideFDR≤0.01筛选过滤，并进行差异蛋白的显著性分析，根据表达倍数和p value值，挑选出差异表达的蛋白质，进行GO分析和KEGG通路注释，寻找可能成为山豆根致肝毒性的潜在生物标志物，并对潜在的靶细胞器（线粒体）进行功能验证:包括制备大鼠肝脏线粒体，JC-1染色法检测线粒体跨膜电位(ΔΨm)、荧光法检测线粒体内ROS生成速率、微孔板比色法检测NAD/NADH比值。　　4.对线粒体途径的山豆根肝细胞凋亡机制研究　　根据蛋白质组学研究结果，推测山豆根在可能和线粒体功能紊乱，诱导肝细胞凋亡有关，为了进一步证实在不同模型上进行进一步研究:利用模式动物斑马鱼模型中采用荧光法测定山豆根对凋亡相关蛋白caspase3/7、caspase8、caspase9活性的影响;在人正常肝细胞L-02模型中采用CCK-8法测定山豆根及苦参碱对细胞增殖的抑制作用;用流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双染法测定山豆根及苦参碱对人正常肝细胞L-02细胞凋亡的影响;用透射电子显微镜观察山豆根及苦参碱对人正常肝细胞L-02细胞亚细胞结构影响，验证其对诱导细胞凋亡的作用;用流式细胞仪PI单染法测定山豆根及苦参碱对L-02细胞周期的影响;用Seahorse细胞能量代谢实时测定仪检测山豆根及苦参碱对L-02细胞糖酵解及有氧呼吸的影响;并取重复给药7天的空白对照组及给药组(山豆根4.5g/kg组，苦参碱200mg/kg)的大鼠肝脏组织测定凋亡相关通路，;qPCR检测山豆根给药大鼠肝细胞凋亡相关基因p53、p65、Caspase3、Caspase8、Caspase9的表达水平;Western Blot检测山豆根给药大鼠肝细胞促凋亡相关蛋白p53、Caspase3、Caspase9、BAX及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。　　5.山豆根大剂量给药早期潜在生物标志物的发现与验证　　采用ELISA法测定山豆根给药不同时间点的大鼠血清炎症子(IL-4，IL-6，IL-10，IL-18，IL-1β);并对蛋白质组学研究中提示的潜在生物标志物谷胱甘肽S转移酶α(glutathione S-transferase，GSTα)、精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinatesynthetase，ASS)进行不同时间点、不同剂量或不同组织样品之间的验证。对给药7天的ALT、GSTα、ASS、IL-10、IL-18、IL-1β进行单项检测的ROC分析。　　结果　　采用优化工艺制备的山豆根浸膏粉中苦参碱及氧化苦参碱含量约为4.33％，不同批次结果接近，色谱图相似度92％。说明此工艺制备的山豆根浸膏粉质量稳定可控。　　山豆根在735.7μg/mL和853.1μg/mL时，可导致斑马鱼肝萎缩和肝变性，在245.2μg/mL时，可显著影响卵黄囊的吸收。并随浓度增加呈现量效关系。对大鼠给予山豆根水提物浸膏粉0.5g/kg、1.5g/kg、4.5g/kg及苦参碱200mg/kg28天的研究结果显示，给药第3天苦参碱组TBiL明显升高;给药第7天，山豆根全组分（≧1.5g/kg）及苦参碱组ALT明显升高;给药14天，山豆根全组分（≧1.5g/kg）及苦参碱组ALT，TBA均明显升高;给药28天，除ALT升高外，山豆根4.5g/kg及苦参碱组ALP明显升高;山豆根4.5g/kg及苦参碱组在不同给药时间点均有肝脏器指数的增加;组织病理学检查见小叶中心性肝细胞肥大，可见脂质变性，且3天程度较轻，7天及14天病变程度有所增加。结果表明山豆根在较高剂量1.5g/kg、4.5g/kg及苦参碱200mg/kg可致大鼠轻度的肝功能异常，主要病理学特征为小叶中心性肝细胞肥大，并可见脂质变性，未见明显的肝细胞坏死。对大鼠高剂量组及苦参碱组的肝细胞应用TUNEL检测，发现光镜下对照组偶见散在自发凋亡细胞，未见明显凋亡，凋亡率为0.15±0.09％，山豆根4.5g/kg及苦参碱组凋亡阳性细胞增加，凋亡率分别为4.41±3.92％、1.82±1.71％，与对照组相比具有明显差异;提示了山豆根在高剂量给药情况下确实能够诱导肝细胞凋亡。　　基于iTRAQ技术的大鼠肝脏组织蛋白质组学研究结果显示，本实验共鉴定出373个差异表达的蛋白质，其中表达上调的有135个蛋白质，表达下调的有238个蛋白质，鉴定出的差异蛋白质以表达下调为主。GO注释及KEGG通路分析显示，山豆根的肝脏毒性机制可能与氧化应激、物质能量代谢障碍、线粒体功能失调，脂质代谢失衡、药物代谢等有关。而对个体差异蛋白的分析显示，GSTα、OAT、Cytcl、TypeI ARG（Ⅰ型精氨酸酶，Arginase-1）有可能成为山豆根肝脏毒性的潜在生物标志物。线粒体功能验证实验表明，山豆根及苦参碱给药7天后，△Ψm下降，线粒体内ROS生成速率增加，NAD/NADH比值升高。　　山豆根对斑马鱼Caspase活性影响的评价结果显示，山豆根在MNLC和LC10浓度条件下，均能增加斑马鱼Caspase3/7、Caspase8和Caspase9的活性。　　山豆根及苦参碱对人正常肝细胞L-02细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响实验发现，山豆根及苦参碱的浓度和作用时间与其对L-02细胞增殖的抑制率成正相关。15h的山豆根和苦参碱IC50分别为10.95mg/mL，2.19mg/mL。山豆根及苦参碱对人肝细胞的毒性是通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞生长周期来实现的，药物处理15h，山豆根12、18 mg/mL组以诱导早期凋亡为主，而20mg/mL则以诱导中晚期凋亡为主;苦参碱组1.67、2mg/mL组可明显诱导早期凋亡。18mg/mL山豆根水提物及1.67mg/mL苦参碱处理15h，透射电镜下观察超微结构可见核仁染色质发生凝聚，严重时细胞裂解出现凋亡小体。山豆根及苦参碱各浓度对细胞周期的影响强于对凋亡的影响，山豆根主要表现为各浓度组对G2/M期的阻滞，并随着浓度的升高（≧18mg/mL）S期延长。苦参碱主要表现为较低浓度时（≦1.67mg/mL）时诱导G0/G1期阻滞，高浓度(2mg/mL)时则诱导G2/M期阻滞，S期延长。　　对细胞能量代谢状态的检测发现18mg/mL的山豆根和1.67mg/mL苦参碱可以使L-02细胞的基础糖酵解水平降低，同时影响细胞的有氧呼吸。随着山豆根和苦参碱浓度的增加，细胞基础代谢率降低，ATP生成减少，同时细胞的最大呼吸能力也明显降低。　　对给药7天高剂量组和苦参碱组大鼠肝细胞凋亡通路的研究发现，对凋亡因子的qPCR结果显示，Caspase8的基因表达水平没有明显增加，Caspase9的基因表达水平明显上调。进一步采用Western Blot法对线粒体诱导细胞凋亡途径的其他关键因子BAX、Bcl-2、p53、Caspase3、Caspase9进行蛋白质水平表达量的检测发现，上游促凋亡因子Bax表达量上升，抑制因子Bcl-2表达下调，Caspase9和Caspase3的表达量没有明显的变化，而其活性形式Cleaved caspase9和Cleaved caspase3的蛋白质表达量都有明显上升，证实了线粒体途径的肝细胞凋亡的发生。结合蛋白质组学研究结果，其路径可能是线粒体功能失调，Cyt c通过Bax孔进入胞质激活Caspase产生级联反应诱导细胞凋亡。　　山豆根早期肝脏毒性潜在生物标志物的发现和验证，对山豆根各剂量组及苦参碱组给药3天和7天大鼠血清GSTα、ASS的检测表明，山豆根≧1.5g/kg及苦参碱组的GSTα给药3天＞2×ULN，早于血清ALT及病理变化，给药7天＞3×ULN。山豆根4.5g/kg和苦参碱组血清ASS在给药7天明显升高;对大鼠血清炎症因子检测的结果显示山豆根及苦参碱组给药3天，各剂量组IL-1β均有升高趋势，其中与同时期对照组相比，山豆根0.5g/kg、1.5g/kg约升高3倍左右，山豆根4.5g/kg和苦参碱组约升高2倍左右;IL-18在给药3天时，各剂量组均有升高趋势，其中山豆根0.5g/kg约升高5倍，山豆根1.5g/kg、4.5g/kg约升高1.6倍左右，而苦参碱组约升高3倍左右。其后变化不明显。其他指标的变化则缺乏剂量关系。对ALT、ASS、GSTα、IL-1β、IL-18、IL-10进行单项检测的ROC曲线分析发现，给药7天，GSTα的诊断效能最高，ALT次之。　　结论　　本研究提示在临床常规剂量下应用山豆根及苦参碱比较安全。在长期、大剂量使用山豆根时，不能排除有肝功能损害发生的风险，因此临床可关注肝功能相关指标。本研究条件下的结果显示，山豆根大剂量或高浓度给药时，早期肝脏病变表现以诱导肝细胞凋亡为主，而未见肝细胞明显坏死，肝功能血清酶学指标轻度异常，病理学改变见肝脏器指数明显增加，小叶中心性山肝细胞肥大，可见脂肪变性。对其凋亡机制的研究发现，山豆根可通过干扰线粒体的能量代谢，下调线粒体跨膜电位同时通过上调促凋亡因子，下调抑制因子以及上调促凋亡的Cleaved caspase9和Cleaved caspase3酶诱导线粒途径的肝细胞凋亡。山豆根和苦参碱的毒性变化性质和程度接近，因此推测苦参碱可能是山豆根毒性的物质基础之一，苦参碱和山豆根一样，在临床合理用药的情况下比较安全，但大剂量长期给药也可能造成肝损伤风险。GSTα可能可作为山豆根及苦参碱大剂量给药条件下早期预警其潜在肝脏毒性的生物标志物。以上研究均为临床安全合理应用山豆根及苦参碱提供了依据。