选择性剪切(Altenative Splicing,AS)是真核生物基因表达调控的重要机制之一,目前发现其与肿瘤的发生密切相关。而针对GLDC基因的选择性剪切调控机制迄今还未见报道。本研究首次在卵巢癌细胞系中确认了一个新的GLDC基因变体和一个错义突变位点,并因此开展了相关功能研究。甘氨酸脱羧酶(Glycine decarboxylase,GLDC)是一个和乳酸代谢相关的致癌基因,在肿瘤起始细胞(或肿瘤干细胞)中高表达,且在维持肿瘤起始细胞存活和增殖乃至肿瘤发生的过程中发挥重要作用。GLDC在多种临床肿瘤组织标本中高表达,尤其在卵巢癌中表现尤为突出,并与患者的死亡率成正相关,所以,GLDC有可能成为针对肿瘤干细胞进而可以有效控制肿瘤进展的有效治疗靶点。而充分了解GLDC生物学作用及其调控机制是研发以GLDC为靶点的抗肿瘤药物以及深入探讨肿瘤的发生、发展机制的重要基础。本实验室前期研究中利用GLDC启动子调控的荧光素酶系统筛选得到可有效抑制GLDC的表达的天然化合物TI13,本研究在此基础上探讨了TI13抑制卵巢癌干细胞相关的抗肿瘤生物学作用。主要的研究结果如下:1.GLDC基因新变体的发现以及各个变体表达载体的构建。首先在mRNA水平上通过RT-PCR结合测序的方法,发现GLDC基因的一个新选择性剪切变体及发现1577位C>G杂合子错义突变位点。接着在基因组上通过RT-PCR结合测序的方法验证mRNA1577位对应的位置存在着GC双峰。之后为了方便接下来的研究成功构建了GLDCV1、GLDCV1 mut、GLDCf1、GLDCf1 mut的真核表达载体。2.GLDC基因各个变体的功能初探。首先在体外实验中,通过在卵巢癌细胞中过表达GLDC各个变体的真核表达载体,发现GLDC的新选择性剪切变体可增强卵巢癌细胞的细胞活力、促进乳酸生成、增强细胞锚定非依赖性克隆形成和平板克隆形成能力、促进卵巢癌干性基因标志物的表达。接着在体内实验中,通过将GLDC基因各个变体的稳转细胞荷瘤的实验,证明GLDC基因的各个变体均可以增强卵巢癌细胞SKOV3的体内的成瘤能力,同时亦证明1577位C>G杂合子突变对GLDC的功能无显著影响。3.化合物TI13对卵巢癌细胞中GLDC表达和细胞活力的影响。通过RT-qPCR和Western Blot的方法,发现TI13可明显的且具有浓度依赖性的抑制卵巢癌细胞系A2780和SKOV3中GLDC的表达。接着通过MTT的方法检测细胞的活力,发现TI13可以抑制细胞的活力且具有浓度依赖性,且对GLDC高表达的A2780细胞的抑制作用要强于其对GLDC低表达的SKOV3的抑制作用。4.化合物TI13对卵巢癌干细胞的影响。首先在体外实验中,化合物TI13明显抑制A2780和SKOV3的乳酸生成、克隆形成能力和卵巢癌干细胞标志物基因的表达;接着在体内裸鼠荷瘤实验,TI13处理的SKOV3细胞肿瘤形成能力明显降低,说明抑制GLDC表达的TI13可针对性地抑制卵巢癌干细胞。5.确认GLDC在化合物TI13抑癌作用中的作用。GLDC过表达可以部分逆转TI13对卵巢癌细胞的乳酸生成和平板克隆形成能力的抑制作用,提示,TI13对卵巢癌干细胞的抑制作用至少部分是通过抑制GLDC的表达来实现的。综上所述,GLDCV1、GLDCV1 mut、GLDCf1、GLDCf1 mut对卵巢癌细胞的活力、乳酸生成、克隆形成能力和卵巢癌干细胞表面标志物有着相似的促进作用,这个结果对GLDC相关疾病发病机理的阐明以及疾病诊断和治疗提供新的思路和方法。另外,化合物TI13不管在体内还是体外的实验中都可以针对性的抑制卵巢癌干细胞,将来将TI13开发成针对卵巢癌干细胞的有效治疗药物奠定了理论基础。