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研究背景与目的鼻咽癌是起源于鼻咽粘膜内膜的一种上皮性的恶性肿瘤。鼻咽癌的恶性程度高,易发生早期器官远处转移及复发。其危险因素包括遗传易感性,环境暴露的空气粉尘污染及EB病毒的感染等。EB病毒是人类疱疹病毒4(HHV4)家族的成员,可以编码丰富的miRNA,在与EB病毒相关的肿瘤中表达丰富,并参与肿瘤的发生发展过程。因此,EB病毒相关重要基因或miRNA及其介导的信号通路研究将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机理过程。肿瘤细胞对化疗药物耐药是肿瘤患者死亡的主要原因。细胞内药物有效浓度的降低、DNA损伤的修复障碍、基因的突变及异常表达、信号转导通路的异常等都参与了肿瘤细胞的多药耐药。在本次研究中,我们确定了 EBV-miR-BART22能够通过MAP2K4/GSK3β/β-catenin信号通路介导的肿瘤干性和EMT信号来诱导顺铂耐药,为鼻咽癌发生发展的分子机制研究提供新思路。研究内容与方法1.利用体内外功能实验探究EBV-miR-BART22在鼻咽癌中的生物学功能及分子机制2.利用生物信息学,双荧光素酶报告实验和Ago2-RIP免疫沉淀检测EBV-miR-BART22 靶基因3.通过EMSA、ChIP、双荧光素酶报告和Western Blot实验检测MAP2K4是否通过下调PI3K/AKT/c-Jun来抑制MYH9表达4.探索MYH9是否调控GSK3β泛素化及激活Wnt/β-catenin通路的机制(1)利用Co-IP和免疫荧光实验检测鼻咽癌细胞中MYH9与GSK3β的相互作用及定位;(2)利用放线菌酮追踪法检测MYH9对GSK3β蛋白半衰期的影响;(3)利用Co-IP实验检测MYH9对GSK3β泛素化的影响;(5)利用免疫荧光实验检测MYH9对β-catenin核浆分离的影响。5.探索MYH9是否可以通过PI3K/AKT/c-Jun调节泛素Ubiquitin表达的机制(1)利用生物信息学,荧光定量PCR,EMSA,ChIP和双荧光素酶实验检测c-Jun是否调节Ubiquitin的转录;(2)Western Blot实验检测在过表达MYH9或加入抑制剂的鼻咽癌细胞中下游蛋白变化;(3)ChIP实验证明加入信号通路抑制剂之后,c-Jun与Ubiquitin的启动子结合量是否有改变;6.利用体外功能实验探究MAP2K4是否拮抗EBV-miR-BART22在鼻咽癌中的生物学功能及其分子机制7.利用体外功能实验探究沉默MYH9是否拮抗EBV-miR-BART22在鼻咽癌中的生物学功能及其分子机制8.分析EBV-miR-BART22,MAP2K4在鼻咽癌组织中的表达量、表达相关性、对预后的影响及与临床病理参数的关系结论(1)EBV-miR-BART22 激活 PI3K/AKT/c-Jun 和 GSK3β/β-catenin 信号通路,促进鼻咽癌细胞干性,侵袭转移以及对顺铂的耐药抵抗;(2)EBV-miR-BART22 直接靶向 MAP2K4;(3)MAP2K4通过下调PI3K/AKT/c-Jun介导的信号通路抑制MYH9转录调控;(4)MYH9与GSK3β相互作用并促进GSK3β蛋白泛素化降解;(5)MAP2K4拮抗EBV-miR-BART22在鼻咽癌中的功能;(6)沉默 MYH9 拮抗 EBV-miR-BART22 的功能;(7)EBV-miR-BART22在鼻咽癌患者组织中呈相对高表达,MAP2K4在鼻咽癌患者组织中呈相对低表达;高表达的EBV-miR-BART22与低表达的MAP2K4的患者预后最差。