研究背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种病因尚未完全明确的累及消化系统的炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)=IBD的发病率和患病率在欧洲和北美等发达国家最高且最为稳定,在我国较欧美国家少见,且病情程度较轻,但是近几年国内IBD的发病率呈逐年上升趋势,重症也常有报道。IBD的发生是由多种因素相互作用引起的,主要与遗传、免疫、感染、环境等因素有关,其中,免疫调节异常在IBD中具有重要的作用已经得到广泛认可。其发病机制目前可概括为遗传背景的易感者,在环境因素及肠道菌丛的参与下,启动肠道免疫系统,在抗原的持续刺激和(或)免疫调节紊乱持续存在的情况下,导致炎症级联的放大和局部炎症介质对组织的损伤,最终导致IBD的发生。CD4+T细胞的免疫失调在感染症、自身免疫病、免疫缺陷症等多种疾病特别是IBD的发生发展中起重要作用,它们参与粘膜炎症的多种免疫反应,并作为免疫调节的中心环节在IBD发病中的作用至关重要。CD4+T细胞传统上被分为辅助性T细胞1型(T helper1, Th1)和辅助性T细胞2型(T helper2, Th2)两个亚群,Th1/Th2失衡多年来一直被认为是IBD的重要因素之一。但是随着研究的深入,有两类不同于Th1和Th2的细胞亚群调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)和辅助性T细胞17型(T helper, Th17)相继被发现,Treg和Th17的发现使人们对IBD的发病机制有了更新的认识,成为Thl/Th2失衡学说的重要补充。研究发现,IBD的免疫紊乱并不是单纯的一种细胞亚群的异常造成的,多亚群之间的免疫紊乱可能共同参与其发病。因此调整CD4+T细胞亚群之间的平衡,重建肠道免疫稳态,或许可以成为缓解肠道炎症的一个新的策略,为治疗IBD提供一个新的思路和手段。目前,临床常用的治疗IBD的药物主要有氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂、炎性介质抑制剂、靶向生物免疫治疗、抗生素等。但长期应用上述药物均有一定的局限性和副作用,因此寻找或者开发研制毒副作用较小而效果肯定的药物十分必要。中医药治疗IBD的特点是多途径、多层次、多靶点并且可以长期维持用药治疗,副作用较少。临床和实验研究发现经典名方黄芩汤治疗IBD疗效甚好且具有一定的免疫调节作用,但黄芩汤治疗IBD的机制尚未完全明确,因此,有必要对此进行深入探讨。鉴于黄芩汤可能有多途径的综合靶点作用,本研究以2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)诱导的结肠炎大鼠模型作为中医药治疗IBD实验研究的模型,以CD4+T细胞亚群为突破点,研究黄芩汤是否具有调节Th1/Th2和Th17/Treg平衡的作用,探讨黄芩汤治疗IBD的免疫机制。第一章黄芩汤对TNBS诱导的结肠炎大鼠干预作用研究目的观察黄芩汤对TNBS诱导的结肠炎大鼠模型的疗效。方法1.TNBS法建立结肠炎大鼠模型及动物分组：将34只SPF级SD大鼠随机分为2组,分别为正常对照组(Control, Cntrl, n=9)和TNBS造模组(n=25)。 TNBS造模组予以30mgTNBS和0.25m150%无水乙醇混合液灌肠,Control组仅注入相应体积的0.9%氯化钠溶液灌肠。造模后第2天,分别从Control组和TNBS造模组随机挑选一只大鼠,取结肠组织做HE染色,证实结肠炎形成。再将造模组大鼠随机分为模型组(TNBS,n=8)、黄芩汤组(Huangqin-Tang, HQT, n=8)和美沙拉嗪组(Mesalazine, ML, n=8)。2.药物治疗：造模24h后开始给药进行干预,分别给予黄芩汤免煎剂(11.6%.0.12g/100g·d)和美沙拉嗪(1%.1ml/100g·d)灌胃治疗,疗程7天。3.HQT对TNBS诱导的结肠炎大鼠模型的疗效评价：每天记录大鼠的饮食、饮水、体重、粪便、毛色、活动和精神状态等一般临床情况,观察腹泻及血便程度,记录大鼠体重变化、疾病活动指数(disease activity index, DAI),实验结束后评价大鼠结肠组织大体形态及组织病理学评分、记录大鼠结肠长度、脾脏和胸腺指数、取结肠组织匀浆检测髓过氧化物酶(my eloperoxidase, MPO)的活性,用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, EILSA)方法检测大鼠结肠组织中肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素1β (interleukin-1β, IL-1β)的水平。统计方法实验采用SPSS16.0统计软件(SPSS for windows)进行统计分析,实验数据用均数±标准差(x±s)表示。两组间比较采用独立样本资料t检验；多组间比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),首先对数据进行方差齐性检验,方差齐时多重比较采用LSD方法检验,如方差不齐时采用近似F检验Welch法进行方差分析,多重比较采用Dunnett’s T3方法检验；重复测量资料采用重复测量数据方差分析的方法进行比较：结肠组织大体和病理评分多组比较采用多个独立样本非参数检验中的Kruskal-Wallis H检验,组间两两比较采用两独立样本非参数检验中的Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.模型验证：造模后模型组大鼠出现少食、懒动、粘液脓血便或稀便；结肠组织呈现不同程度损伤,肉眼观察可见结肠粘膜充血、糜烂、溃疡形成；光镜下可见结肠黏膜上皮脱落、坏死,粘膜下层可见大量炎细胞,提示造模成功。2.与Control组比较,TNBS组体重下降明显(P<0.001)、DAI评分显著升高(P<0.001)、结肠缩短(t=6.662,P<0.001)、脾脏指数升高(t=-7.497,P<0.001),两组比较有显著性差异；胸腺指数降低,但与Control组比较无显著性差异(t=1.009,P=0.330)；结肠组织大体形态和组织病理学评分升高(Z=-3.566, P<0.001; Z=-3.578, P<0.001), MPO活性升高(t=-11.870,P<0.001),结肠组织中TNF-a和IL-1β的表达水平明显增高(t=-26.750, P<0.001; t=-25.228, P<.001),与Control组比较均有显著性差异。3.与TNBS组比较,HQT和ML能够缓解TNBS诱导的结肠炎大鼠的疾病严重程度,治疗7天后,HQT和ML组大鼠精神好转,毛色渐有光泽,食欲增加,动作增多,反应灵活,大便成型较多,少见稀软粪便,体重增加,与TNBS组比较有显著差异(P<0.001)；各组大鼠结肠长度差异有显著意义(F=6.918,P=0.005), HQT组和ML组较TNBS组大鼠均增加,差异有显著性意义(P=0.002, P=0.019), HQT组和ML组比较无显著差异(P=0.293)；HQT组和ML组DAI评分均不同程度降低,与TNBS组比较差异有显著性意义(P<0.001)；各组大鼠脾脏指数比较有显著差异(F=19.939, P<0.001), HQT组和ML组大鼠脾脏指数与TNBS组比较均降低,差异有显著性意义(P<0.001), HQT组和ML组比较无显著差异(P=0.467)；三组大鼠胸腺指数比较无显著差异(F=1.426,P=0.263)；各组大鼠结肠组织大体形态及组织病理学评分差异有显著意义(x2=16.334, P<0.001; x2=15.205, P<0.001), HQT组和ML组结肠组织大体形态及组织病理学观察可见不同程度的改善,评分与模型组比较有显著性差异(P=0.001, P=0.001), HQT组与ML组比较差异没有统计学意义(P=0.232)；各组大鼠MPO活性比较有显著性差异(F=76.889, P<0.001), HQT和ML治疗组的MPO活性显著降低,与TNBS组比较差异有显著意义(P<0.001), HQT与ML组比较无差异(P=0.364)。不同组间TNF-α和IL-1β的表达有显著性差异(F=213.973,P<0.001；F=191.073,P<0.001), HQT组和ML组TNF-α和IL-1β的表达明显降低,与TNBS组比较有显著性差异(P<0.001), HQT与ML组比较无显著差异(P=0.595：P=0.163)。结论1.TNBS30mg和0.25ml50%无水乙醇混合液灌肠能够诱导出理想的大鼠模型,因此确定在本实验中TNBS30mg是最佳的造模剂量。2.黄芩汤能够通过抑制体重降低、减少腹泻及黏液血便、降低DAI评分、恢复脾脏指数、修复结肠黏膜损伤、降低结肠大体评分和病理学评以及MPO活性、降低促炎因子TNF-α和IL-1β的表达等几个方面降低疾病的严重程度,起到了一定的抗炎和黏膜修复的作用,对TNBS诱导的结肠炎具有一定的改善作用。第二章黄芩汤对TNBS诱导的结肠炎大鼠Thl/Th2平衡的影响目的观察黄芩汤对TNBS诱导的结肠炎大鼠Th1/Th2平衡是否具有调节作用,从CD4+T细胞亚群平衡的角度探讨黄芩汤治疗IBD的免疫学机制。方法1.TNBS法建立结肠炎大鼠模型及动物分组：将34只SPF级SD大鼠随机分为2组,分别为正常对照组(Control, Cntrl, n=9)和TNBS造模组(n=25)。TNBS造模组予以30mg TNBS和0.25ml50%无水乙醇混合液灌肠,Control组仅注入相应体积的0.9%氯化钠溶液灌肠。造模后第2天,分别从Control组和TNBS造模组随机挑选一只大鼠,取结肠组织做HE染色,证实结肠炎形成。再将造模组大鼠随机分为模型组(TNBS, n=8)、黄芩汤组(Huangqin-Tang, HQT, n=8)和美沙拉嗪组(Mesalazine, ML, n=8)。2.药物治疗：造模24h后开始给药进行干预,分别给予黄芩汤免煎剂(11.6%.0.12g/100g·d)和美沙拉嗪(1%.1ml/100g·d)灌胃治疗,疗程7天。3. ELISA方法检测大鼠结肠组织中Thl细胞因子干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、 IL-12和Th2细胞因子IL-4、IL-13以及IL-12p70的表达水平。4. Real-Time PCR方法检测大鼠结肠组织中IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-13的mRNA表达水平。5. Western blot方法检测大鼠结肠组织中Thl特异性转录因子T细胞中T-box (T-box expressed in T cells, T-bet)和Th2特异性转录因子GATA结合蛋白3(GATA family of transcription factors3, GATA-3)的蛋白表达水平。统计方法实验采用SPSS16.0统计软件(SPSS for windows)进行统计分析,实验数据用均数±标准差(x±s)表示。两组间比较采用独立样本资料t检验；多组间比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),首先对数据进行方差齐性检验,方差齐时多重比较采用LSD方法检验,如方差不齐时采用近似F检验Welch法进行方差分析,多重比较采用Dunnett’s T3方法检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1. ELISA结果显示,TNBS组IFN-y和IL-12表达明显增多,与Control组比较有显著性差异(t=-16.597, P<0.001;t=-15.966, P<0.001), IL-4和IL-13表达与Control组比较无显著差异(t=-1.610, P=0.130;t=-2.061, P=0.063); TNBS组、HQT组和ML组三组比较,各组IFN、IL-12、IL-4和IL-13的表达比较均有显著性差异(F=117.449,P<0.001; F=91.052, P<0.001; F=30.377, P<0.001;F=73.923,P<0.001), HQT和ML能有效抑制IFN-y和IL-12的表达,而显著升高IL-4和IL-13表达,与模型组比较有显著性差异(P<0.001), HQT组和ML组中IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-13表达比较均无差异(P>0.05)。2. Real-Time PCR结果显示,与Control组比较,TNBS组IFN-y和IL-12mRNA表达升高,两组比较有显著性差异(t=-14.062, P<0.001;t=-23.781,P<0.001),而IL-4和IL-13mRNA表达与Control组比较无显著性差异(t=0.582, P=0.570; t=0.475, P=0.642); TNBS组、HQT组和ML组三组比较,IFN-γ、 IL-12、IL-4和IL-13mRNA表达比较均有显著性差异(F=29.596, P<0.001; F=53.134,P<0.001; F=41.375, P<0.001; F=59.066,P<0.001), HQT和ML能有效的抑制IFN-y和IL-12mRNA表达,显著升高IL-4和IL-13mRNA表达,与TNBS组比较有显著性差异(P<0.001),HQT组和ML组中IFN-γ、 IL-12、IL-4和IL-13mRNA表达比较均无差异(P>0.05)。3. ELISA结果显示,TNBS组IL-12p70的表达显著升高,与Control组比较差异有显著性意义(t=16.546,P<0.001)；TNBS组、HQT组和ML三组比较,各组大鼠结肠组织中IL-12p70的表达均有显著性差异(F=17.327,P<0.001), HQT和ML治疗能够有效的降低IL-12p70的表达,与TNBS组比较差异有显著性意义(P<0.001), HQT组和ML组IL-12p70表达比较无显著差异(P=0.697)。4. Western blot结果显示,各组间T-bet和GATA-3蛋白表达均数有显著差异(F=23.500, P<0.001; F=36.417, P<0.001), HQT和ML均能够显著降低T-bet的表达,与TNBS组比较有显著性差异(P<0.001), HQT组和ML组之间比较无显著差异(P=0.084); HQT和ML均能提高GATA-3的表达,与TNBS组比较有显著性差异(P<0.001), HQT组和ML组比较差异有显著性意义(P<0.001)。结论黄芩汤可以抑制TNBS诱导的结肠炎大鼠Thl细胞因子IFN-γ和IL-12蛋白和]mRNA的表达、转录因子T-bet蛋白的表达,而促进Th2细胞因子IL-4和IL-13蛋白和mRNA的表达、转录因子GATA-3蛋白的表达,提示黄芩汤能够通过对炎性细胞因子和转录因子的调节作用使IBD中异常的Th1/Th2漂移趋向平衡,这可能是其发挥抗炎和保护肠黏膜作用的免疫机制之一。同时,黄芩汤可通过对树突状细胞(dendritic cell, DC)分泌的IL-12p70的抑制进而影响幼稚T细胞向Thl细胞分化。第三章黄芩汤对TNBS诱导的结肠炎大鼠Th17/Treg平衡的影响目的观察黄芩汤对TNBS诱导的肠炎大鼠Th17/Treg失衡是否具有调节作用,从CD4+T细胞亚群平衡的角度探讨黄芩汤治疗IBD的免疫学机制。方法1.TNBS法建立结肠炎大鼠模型及动物分组：将34只SPF级SD大鼠随机分为2组,分别为正常对照组(Control, Cntrl, n=9)和TNBS造模组(n=25)。TNBS造模组予以30mg TNBS和0.25m150%无水乙醇混合液灌肠,Control组仅注入相应体积的0.9%氯化钠溶液灌肠。造模后第2天,分别从Control组和TNBS造模组随机挑选一只大鼠,取结肠组织做HE染色,证实结肠炎形成。再将造模组大鼠随机分为模型组(TNBS, n=8)、黄芩汤组(Huangqin-Tang, HQT, n=8)和美沙拉嗪组(Mesalazine, ML, n=8)。2.药物治疗：造模24h后开始给药进行干预,分别给予黄芩汤免煎剂(11.6%.0.12g/100g·d)和美沙拉嗪(1%.1ml/100g·d)灌胃治疗,疗程7天。3. ELISA方法检测各组大鼠结肠组织中Th17细胞因子IL-17和IL-6, Treg细胞因子IL-10和转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)以及IL-23p19的表达。4. Real-Time PCR方法检测各组大鼠结肠组织中Th17细胞因子IL-17、IL-6mRNA以及Treg细胞因子IL-10、TGF-β1mRNA的表达水平。5. Western blot方法检测各组大鼠结肠组织中Thl7特异性转录因子核孤儿受体γt (orphan nuclear receptor γt, RORγt)和Treg特异性转录因子叉头蛋白P3(forkhead box P3, Foxp3)的蛋白表达水平。统计方法实验采用SPSS16.0统计软件(SPSS for windows)进行统计分析,实验数据用均数±标准差(x±s)表示。两组间比较采用独立样本资料t检验；多组间比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),首先对数据进行方差齐性检验,方差齐时多重比较采用LSD方法检验,如方差不齐时采用近似F检验Welch法进行方差分析,多重比较采用Dunnett’s T3方法检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1. ELISA结果显示,TNBS组IL-17和IL-6的表达显著升高,与Control组比较差异有显著性意义(t=-120.374, P<0.001; t=-32.119, P<0.001), IL-10和TGF-β表达与Control组比较无显著差异(t=1.929, P=0.740; t=-1.153, P=0.268); TNBS组、HQT组和ML组三组比较,各组间IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β表达比较均有显著差异(F=2781.000,P<0.001; F=353.682,P<0.001; F=51.648, P<0.001; F=406.863, P<0.001), HQT和ML组中IL-17和IL-6的表达水平明显降低,与TNBS组比较差异有显著性意义(P<0.001); HQT和ML能够提高IL-10和TGF-β的表达,与TNBS组比较差异有显著性意义(P<0.001)。HQT组与ML组比较,IL-17、IL-6和TGF-β表达差异有显著性意义(P<0.001),IL-10表达比较无显著差异(P=0.310)。2.Real-Time PCR结果显示,与Control组比较,TNBS组IL-17和IL-6mRNA表达显著升高,差异有显著意义(t=-14.130, P<0.001;t=-30.937, P<0.001),而IL-10mRNA表达降低,TGF-β1mRNA表达轻度升高,与Control组比较有显著差异(t=-5.741, P<0.001; t=-5.121, P<0.001); TNBS组、HQT组和ML组三组比较,各组间IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β mRNA表达有显著差异(F=59.044, P<0.001; F=138.630, P<0.001; F=472.083, P<0.001; F=96.585, P<0.001), HQT和ML治疗能够显著降低IL-17和IL-6mRNA的水平而明显升高IL-10和TGF-β1mRNA的表达,与TNBS组比较差异有显著性意义(P<0.001), HQT组和ML组比较IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β1mRNA表达差异均有显著性意义(P<0.001; P<0.001; P<0.001; P=0.033)3. ELISA结果显示,TNBS组IL-23p19的表达显著升高,与Control组比较差异有显著性意义(t=-9.021, P<0.001); TNBS组、HQT组和ML组三组比较,各组IL-23p19的表达均有显著性差异(F=19.033, P<0.001), HQT和ML治疗能够有效的降低IL-23p19的表达,与TNBS组比较差异有显著性意义(P<0.001), HQT组和ML组IL-23p19表达比较无显著差异(P=0.991)。4. Western blot结果显示,各组间RORyt和Foxp3的表达比较存在显著差异(F=23.012, P<0.001; F=59.204, P<0.001), HQT和ML治疗后,RORyt表达降低而Foxp3的表达显著升高,与TNBS组比较有显著性差异(P<0.001)。HQT和ML两组比较RORyt和Foxp3表达均有显著差异(P=0.033；P<0.001)。结论黄芩汤可以抑制TNBS诱导的结肠炎大鼠Th17细胞因子IL-17和IL-6蛋白和mRNA的表达、转录因子RORyt蛋白的表达,提高Treg细胞因子IL-10和TGF-β蛋白和mRNA的表达、转录因子Foxp3的蛋白水平,提示通过对细胞因子和转录因子的调节作用,使失衡的Th17/Treg亚群趋向平衡,这可能是黄芩汤发挥抗炎和保护肠黏膜作用的免疫机制之一。黄芩汤可通过对DC分泌的IL-23p19的抑制进而影响幼稚T细胞向Th17细胞分化。