地方性砷中毒及工农业生产所致砷化物污染严重危害人类健康。长期摄入砷化物可引起多种癌症,其中主要是皮肤癌、肺癌和膀胱癌等,因此,砷化物已被国际癌症研究机构(IARC)确认为人类确定(Ⅰ类)致癌物,但砷化物致癌机制目前尚不清楚。目前,有关砷化物致癌的机制可概括为两类,即遗传学机制和表观遗传学机制,后者包括DNA甲基化模式改变、组蛋白修饰异常和微小RNA (microRNAs, miRNAs)表达异常等。已研究发现砷化物可引起机体和组织细胞活性氧(ROS)水平升高,其所致氧化应激被认为是砷化物所致机体损伤的重要机制之一,但其具体分子过程有待进一步深入研究。近年,有研究发现过量ROS主要引起细胞产生氧化应激损伤；而适量ROS对细胞具有广泛调节功能,参与细胞信号转导,从而促进细胞增殖。miRNAs参与了多种肿瘤的发生和发展过程,其可以起到抑癌基因或癌基因的作用。miR-21作为癌基因类miRNAs,其在多种肿瘤中表达高表达,已发现miR-21具有调节细胞增殖、分化、凋亡与迁移的功能。有研究发现辐射可使正常肝细胞ROS水平升高,而使肝细胞miR-21水平升高,从而引发肝癌。因此,ROS可以引起细胞miR-21水平升高。根据本课题组以往研究发现低水平亚砷酸钠(NaAsO2)慢性处理所致细胞恶性转化和生产适量ROS研究结果,结合文献报道ROS可引起细胞miR-21水平升高,我们假设ROS和miR-21参与了低水平NaAsO2所致细胞恶性转化过程。低水平砷化物对miR-21水平的影响及其在所致细胞增殖、恶性转化和致癌过程中的作用未见研究报道。为此,本研究在课题组前期构建的低水平NaAsO2漫性处理所致人胚肺成纤维(HELF)细胞恶性转化模型基础上,应用多种分子生物学方法探讨ROS和miR-21在低水平NaAsO2所致HELF细胞恶性转化过程中的作用及其分子过程,以揭示低水平砷化物所致细胞恶性转化的部分分子机制,从而为进一步理解砷化物致癌的分子机制和寻找砷中毒的生物学标志及防治措施提供一定的科学依据。方法一、低水平亚砷酸钠慢性处理所致HELF细胞恶性转化和生长动力学改变分别用0.0或1.0μM NaAsO2处理HELF细胞10、20或30代后,用软琼脂集落实验检测细胞集落数,以观察HELF细胞恶性程度；用细胞计数方法计算HELF细胞倍增时间,以观察细胞生长动力学改变。二、低水平亚砷酸钠对HELF细胞miR-21水平的影响分别用0.0或1.0μM NaAsO2慢性处理HELF细胞10、20或30代后；或分别用1.0μM NaAsO2处理HELF细胞0、1、3、6、12或24h。提取细胞总RNA,用实时定量PCR (qRT-PCR)检测miR-21水平。三、miR-21在低水平亚砷酸钠所致HELF:细胞增殖中的作用分别将150nM anti-miR-nc或anti-miR-21转染HELF细胞24h,再用0或1.0μM NaAsO2处理HELF细胞24h。提出细胞总RNA,用qRT-PCR检测miR-21水平；用CCK-8法计算细胞相对增殖率。四、低水平亚砷酸钠对HELF细胞ERK和NF-κB激活的影响分别用0.0或1.0μM NaAsO2处理HELF细胞10、20或30代；或用1.0μMNaAsO2急性处理HELF细胞0、1、3或6h。提出细胞总蛋白,用Western blot检测ERK. NF-κB p65、p-ERK和P-NF-κB p65水平。五、ROS在低水平亚砷酸钠所致HELF细胞miR-21水平升高和ERK及NF-κB激活中的作用分别用0.0或1.0μM NaAsO2处理HELF细胞24h,再用1.5U超氧化物岐化酶(SOD)处理HELF细胞1h；或用10nM过氧化物酶(Catalase)预处理HELF细胞1h,再分别联合用0.0或1.0μM NaAsO2或者0.0或10.0μM H2O2处理HELF细胞24h。提取细胞总蛋白及总RNA,分别用二氢乙锭(DHE)或2’,7’-二氯荧光素二酯(DCFH-DA)检测超氧化物阴离子或过氧化物水平；或用qRT-PCR检测miR-21水平；或用Western blot检测ERK、NF-κB p65、p-ERK和P-NF-κB p65水平。六、ERK和NF-KB在低水平亚砷酸钠所致HELF细胞miR-21水平升高中的作用分别用10μM ERK抑制剂U0126或NF-κB抑制剂Bay11-7082预处理HELF细胞3h,或用20nM control siRNA或NF-κB p65siRNA分别预处理HELF细胞24h,再联合用0.0或1.0μM NaAsO2处理HELF细胞24h。提取细胞总蛋白和总RNA,用qRT-PCR检测miR-21水平；用Western blot检测ERK、IKB a和NF-κB p65、p-ERK、p-NF-κB p65、p-IκB a、Pten、Pdcd4、Spry1和Spry2水平；用免疫荧光检测P-NF-κB p65细胞内分布情况；用基因序列分析并用ChIP方法检测NF-κB与miR-21启动子区结合情况。七、miR-21通过靶蛋白Spry1反馈调控ERK激活用150nM anti-miR-21或anti-miR-nc预处理HELF细胞,再用0.0或1.0μMNaAsO2处理HELF细胞1或24h。提取细胞总蛋白,用Western blot检测ERK、p-ERK和Spry1水平。八、上调miR-21对低水平亚砷酸钠慢性处理HELF细胞恶性程度和迁移能力的影响及其调控机制分别用150或100nM miR-21-mimic处理正常HELF或1.0μM NaAsO2慢性处理10代HELF细胞24h。提取细胞总蛋白和总RNA,用qRT-PCR检测miR-21水平；用软琼脂集落实验检测细胞恶性程度；用划痕实验检测细胞迁移能力；Western blot实验检测ERK、 NF-κB p65. p-ERK、p-NF-κB p65和Spry1水平。九、下调miR-21对低水平亚砷酸钠所致恶性转化HELF细胞恶性程度和迁移能力的影响及其调控机制分别用150nM anti-miR-21转染1.0μM NaAsO2漫性处理30代恶性转化HELF细胞24h。提取细胞总蛋白和总RNA,用qRT-PCR检测miR-21水平；用软琼脂集落实验检测细胞恶性程度；用划痕实验检测细胞迁移能力；Western blot实验检测NF-κB p65、p-ERK、p-NF-κB p65和Spryl水平。结果一、低水平亚砷酸钠慢性处理所致HELF细胞恶性转化和生长动力学改变1.0μM NaAsO2慢性处理20和30代恶性转化HELF细胞所形成的集落数显著高于传代对照HELF细胞和1.0μM NaAsO2;慢性处理10代HELF细胞；1.0μtMNaAsO2慢性处理10、20和30代HELF细胞的倍增时间均显著低于传代对照HELF细胞。结果提示低水平NaAsO2慢性处理可引起HELF细胞发生恶性转化,并随处理时间延长,恶性程度越大；且恶性转化HELF细胞增殖速率明显加快。二、低水平亚砷酸钠对HELF细胞miR-21水平的影响1.0μM NaAsO2慢性处理10、20和30代HELF细胞miR-21水平均显著高于传代对照HELF细胞；1.0μM NaAsO2处理3、6、12和24h后,HELF细胞miR-21水平显著高于对照HELF细胞。结果提示低水平NaAsO2急性和慢性处理引起HELF细胞miR-21水平升高,并具有一定时间效应关系。三、miR-21在低水平亚砷酸钠所致HELF细胞增殖中的作用150nM anti-miR-21显著抑制1.0μM NaAsO2所致HELF细胞miR-21水平升高；且anti-miR-21可明显阻滞1.0μM NaAsO2所致HELF细胞增殖加快。结果提示miR-21在低水平NaAsO2所致HELF细胞增殖中具有重要作用。四、低水平亚砷酸钠对HELF细胞ERK和NF-κB激活的影响1.0μM NaAsO2慢性处理10、20和30代的HELF细胞p-ERK和p-NF-κB p65水平均明显高于传代对照HELF细胞,且随代数(细胞恶性程度)增加而其升高越明显；1.0μM NaAsO2处理1、3和6h后,HELF细胞p-ERK和P-NF-κB p65水平均显著高于对照HELF细胞。结果提示低水平NaAsO2急性和慢性处理可引起HELF细胞ERK和NF-κB激活。五、ROS在低水平亚砷酸钠所致HELF细胞miR-21水平升高和ERK及NF-κB激活中的作用1.0μM NaAsO2引起HELF细胞超氧化物阴离子、过氧化物、miR-21、p-ERK和p-NF-κB p65水平明显升高；而用SOD或Catalase则可阻滞1.0μM NaAsO2引起的HELF细胞miR-2、p-ERK和p-NF-κB p65水平升高。结果提示ROS包括超氧化物阴离子和过氧化物参与了低水平NaAsO2所致HELF细胞miR-21水平升高和ERK和NF-κB激活。六、ERK和NF-κB在低水平亚砷酸钠所致HELF细胞miR-21水平升高中的作用1.0μM NaAsO2引起HELF细胞p-ERK、p-IκB α、p-NF-KB p65和miR-21水平升高、核内P-NF-κB p65蛋白荧光强度明显升高及miR-21靶蛋白Pten、Pdcd4和Spry1水平降低；而应用ERK抑制剂U0126可明显阻滞1.0μM NaAsO2所引起的以上改变；通过NF-κB抑制剂Bay11-7082和NF-κB p65siNRA处理关闭NF-κB也可明显阻滞1.0μM NaAsO2引起的以上改变；miR-21启动子DNA序列存在κB序列；1.0μM NaAsO2引起NF-κB p65与miR-21启动子区结合量升高,而Bay11-7082则可阻滞两者结合。结果提示ERK调控NF-κB激活参与了低水平NaAsO2所致miR-21水平升高。七、miR-21通过靶蛋白Spry1反馈调控ERK激活1.0μM NaAsO2处理早期(1h)即引起HELF细胞p-ERK水平显著升高,而在处理晚期(24h)才引起HELF细胞Spry1水平明显降低；下调miR-21明显阻滞1.0μM NaAsO2所致HELF细胞p-ERK水平升高和Spry1水平降低。结果提示miR-21通过靶蛋白Spryl反馈调控ERK激活。八、上调miR-21对低水平亚砷酸钠慢性处理HELF细胞恶性程度和迁移能力的影响及其调控机制分别用150或100nM miR-21-mimic处理正常HELF或1.0μM NaAsO2慢性处理10代HELF细胞,获得miR-21高表达水平基本一致；通过转染miR-21-mimic而上调miR-21使1.0μM NaAsO2慢性处理10代HELF细胞在软琼脂上形成集落数和细胞划痕愈合率均明显升高,p-ERK和p-NF-κB p65水平也明显升高,而Spry1水平则明显降低。结果提示上调miR-21可促进低水平NaAsO2慢性处理10代HELF细胞的恶性程度和迁移能力及通过下调Spry1水平而反馈激活ERK/NF-κB通路。九、下调miR-21对低水平亚砷酸钠所致恶性转化HELF细胞恶性程度和迁移能力的影响及其调控机制通过转染150nM anti-miR-21而下调miR-21使1.0μM NaAsO2慢性处理30代恶性转化HELF细胞在软琼脂上形成集落数和细胞划痕愈合率均明显降低,p-ERK和p-NF-κB p65水平明显降低,而Spry1水平则明显升高。结果提示下调miR-21可抑制低水平NaAsO2所致30代恶性转化HELF细胞恶性程度和迁移能力及通过上调Spryl水平而反馈抑制ERK/NF-κB通路。结论1、低水平亚砷酸钠慢性和急性处理引起HELF细胞miR-21水平升高及ERK和NF-κB激活。2、miR-21参与了低水平亚砷酸钠所致HELF细胞增殖和恶性转化过程。3、ROS通过调控ERK/NF-κB参与了低水平亚砷酸钠所致HELF细胞miR-21水平升高过程。4、miR-21通过靶基因Spry1反馈调控ERK/NF-κB通路。5、miR-21促进低水平亚砷酸钠所致HELF细胞恶性程度和迁移能力。总之,本研究结果提示低水平亚砷酸钠引起HELF细胞产生适量ROS,从而激活ERK/NF-κB信号通路,引起miR-21水平升高,并通过抑制靶蛋白Spry1反馈促进ERK/NF-κB激活,从而引起HELF细胞异常增殖,最终导致细胞恶性转化。