椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)被认为是骨科最常见的疾病之一,也是导致颈部或腰背部疼痛的主要原因,已成为主要的公共卫生问题,在世界范围内对社会经济造成重大影响。IDD的病因是复杂和多因素的,包括基因遗传、年龄、营养代谢、生物力学等。尽管引发该疾病的机制乃存在争议,但普遍认为IDD是由于椎间盘细胞合成代谢和分解代谢之间不平衡导致椎间盘细胞外基质减少所致。目前临床治疗方法包括保守治疗和手术治疗,仅能减轻症状,无法阻止IDD的发生和发展,目前缺乏理想的治疗方法能够逆转IDD病变。近来生物治疗IDD的技术逐渐得到发展,包括细胞治疗、组织工程、生长因子和/或生物活性化合物。无机多聚磷酸盐(inorganic polyphosphate,PolyP)作为一种生物活性化合物广泛存在自然界和所以生物体中,它是由几个至数百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合而成的线性多聚体。研究认为PolyP的共价键中储存高能量,其释放出来的能量可参与氨基酸、核苷酸、糖和脂类这些主要分子的构建。在体外实验中已报道PolyP能够增加软骨细胞及软骨组织基质的合成。此外,研究发现在牛的椎间盘组织中检测到PolyP,0.5-1.0mM浓度的PolyP可以通过上调髓核细胞基质基因的表达从而提高髓核组织合成代谢。目前PolyP对人的椎间盘细胞基质和能量代谢的影响尚未见研究报道。因此,我们假设PolyP作为一种能量来源,能增加人椎间盘细胞外基质的合成从而有利于干预和逆转IDD。第1部分无机多聚磷酸盐对椎间盘细胞增殖和基质代谢的影响目的:研究PolyP对人椎间盘纤维环细胞增殖和基质代谢的影响。方法:体外分离培养人椎间盘纤维环细胞,用三种不同浓度0,0.5mM和1.OmM PolyP-22(22磷酸盐单位长度的PolyP)处理人的椎间盘纤维环细胞,在倒置的显微镜下观察PolyP处理后的纤维环细胞在不同时间点的细胞形态学变化,并采用CyQUANT细胞增殖试剂法检测细胞的增殖活性变化。利用不同浓度 PolyP 处理纤维环细胞 48 小时后,用 1,9-DimethylmethyleneBlue(DMMB)方法测定细胞糖胺聚糖含量、采用同位素35S-硫酸盐标记法检测细胞蛋白聚糖的合成量,采用同位素3H-脯氨酸标记法检测细胞胶原蛋白和总蛋白的合成量。结果:PolyP能够提高人椎间盘纤维环细胞的增殖活性;采用DMMB方法测定和同位素标记法检测的结果也表明PolyP能够增加细胞糖胺聚糖,蛋白聚糖,胶原蛋白和总蛋白的合成量。结论:PolyP能够促进纤维环细胞增殖,并能提高细胞基质的合成量。第2部分无机多聚磷酸盐对椎间盘细胞基质代谢的作用机制目的:探讨PolyP对椎间盘内细胞基质合成和分解代谢动态平衡的影响;以及探讨PolyP对椎间盘细胞ATP生成量的影响。方法:用三种不同浓度0,0.5mM和1.OmM的PolyP-22处理人的椎间盘纤维环细胞48小时后;用qRT-PCR检测合成代谢的活性介质聚集蛋白聚糖(aggrecan)和I型胶原(collagenI)的mRNA的表达,以及检测分解代谢的活性介质基质金属蛋白酶-1(matrix metalloprotease-1,MMP-1)、MMP-3、血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS-4)和 ADAMTS-5 的 mRNA 的表达;采用蛋白免疫印迹(Western Blot)和免疫荧光细胞化学检测法在蛋白水平检测合成代谢的标志物aggrecan和collagen I的表达,并采用Western Blot检测分解代谢标志物aggrecan-fragment的蛋白表达;最后,利用ATPlite荧光免疫法测定三种不同浓度PolyP处理椎间盘细胞后在不同时间点的ATP生成量的变化。结果:qRT-PCR结果分析说明PolyP处理的人椎间盘纤维环细胞中,细胞代谢合成的aggrecan和collagen I的mRNA表达得到上调,但是在代表分解代谢的基因表达中,PolyP上调MMP-3和ADAMTS-4的mRNA表达而降低MMP-1和ADAMTS-5的mRNA表达。免疫荧光和Western Blot的结果同样证明PolyP能够增加椎间盘治疗纤维环细胞中aggrecan和collagen I的蛋白表达。但是Western Blot的结果表明分解代谢aggrecan-fragment的蛋白表达升高。同时PolyP能够增加人椎间盘纤维环细胞的ATP的生成量。结论:在椎间盘纤维环细胞中,增加PolyP含量可以上调细胞基质合成基因的表达和ATP生成量,促进纤维环细胞的合成代谢,但要确定PolyP如何在椎间盘细胞中调节分解基质代谢和整体代谢平衡还需要更多的验证性研究。