胰腺癌是一种临床表现隐匿、早期诊断困难、发展迅速和预后极差的消化系统恶性肿瘤。近年来其发病率呈逐年上升的趋势，每年有新发病例约20万人，手术切除仍是目前治疗胰腺癌的主要手段。但是由于胰腺癌的病理及生物学特点使其早期症状缺乏特异性，早期诊断相当困难。胰腺癌约50%的患者就诊时已有远处转移，35％的患者表现为肿瘤局部的晚期性病变，手术切除率只有15%，5年生存率仅有1%-5%。因此，有效治疗胰腺癌、改善预后的关键就是对胰腺癌的早期发现和早期诊断。随着消化内镜的发展，超声内镜(EUS)为胰腺肿瘤的诊断带来了重大进步，其诊断灵敏度较高，同时在EUS监视下对胰腺肿瘤进行细针抽吸活检术(FNA)，可以对获取的穿刺物进行病理学检查（液积细胞或者组织学），这在术前对肿瘤的良、恶性鉴别诊断是有意义和价值的。但是临床操作过程中，穿刺吸取的标本量过少、涂片质量差或病理医生的经验不足，都会出现假阴性。根据分子生物学检测高敏感的特点，对部分细胞学表现不典型或病理学可疑恶性的患者的穿刺物运用分子生物学技术进行检测鉴别，对部分患者可避免可能的多次穿刺检查，而对于良性占位病变的患者甚至可避免开腹手术的创伤，从而减少并发症的发生率，也可尽早发现胰腺癌而改善其预后，减少死亡率。因此发现并检测FNA标本的胰腺癌特异性标志物，为胰腺癌早期诊断开辟了新的途径。目前的研究表明，与胰腺癌最为密切的基因改变是K-ras基因第12或13密码子的突变，其突变率为75%-100%。在胰腺癌的早期阶段就可以检测到该突变的发生，因此可以为早期诊断提供重要依据。本研究设计通过肽核酸（PNA）钳制的方法，定性检测EUS-FNA穿刺物中K-ras基因的突变情况；并且通过设计双荧光标记的探针，应用实时定量的方法定量检测K-ras基因的突变情况，探讨K-ras突变在质和量方面对胰腺癌的诊断价值。在我们的研究中，除了选择经典的K-ras基因，我们还对既往文献报道的胰腺癌组织中差异表达的miRNA在EUS-FNA标本中进行了检测，并探讨其诊断价值。在我们的实验中，通过定性检测，我们检测到文献报道的4种常见的12密码子突变（GGT→GAT、GGT→GTT、GGT→GCT、GGT→CGT)及1种13密码子突变（GGC→GAC）。54例胰腺癌患者K-ras基因的突变率88.9%(95%CI:80.5%-97.2%)，尤其对于细胞学不能诊断的患者，联合血清CA-199结果，诊断的灵敏度81%(95%CI:64.2,97.7)。在定量检测的试验中，胰腺癌患者的K-ras基因突变拷贝数明显高于非恶性胰腺占位组，对胰腺癌的诊断具有一定的价值。在我们检测7条miRNA中，miRNA-210、miRNA-21、miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-196a在胰腺癌组织中的表达与非胰腺癌患者组织比较差异有统计学意义（P<0.05）。其中miRNA-196a与胰腺癌局部淋巴结转移和肿瘤分期具有明显相关关系（P=0.023，P=0.047）。这说明miRNA与胰腺癌的发生及临床生物学行为有关。通过以上实验，我们证实了EUS-FNA穿刺物的基因检测是可行的，而我们用于检测K-ras基因突变及miRNA的方法灵敏度高、操作简便，为胰腺癌的早期诊断提供了新的思路。此外，为胰腺癌变分子机理的研究及治疗提供理论依据，也是胰腺癌相关基础研究向临床转化的新的尝试。