本研究以水曲柳(Fraxinus mandshurica)下胚轴、根、子叶、组培苗茎段为外植体诱导愈伤组织和不定芽,优化诸影响离体再生的因素,建立愈伤组织再生技术;分析愈伤组织再生过程中激素含量、相关基因表达和表观修饰变化,以及三者相应关系,解析不定芽发生机制;进一步克隆再生过程关键调控基因FmWIND1,分析其基因序列及表达模式;从而为规模化水曲柳组培微繁和建立遗传转化技术奠定基础,丰富再生理论。主要结果如下:1.影响愈伤组织发生和不定芽分化的诸因素分析:通过比较下胚轴、根、子叶和组培苗茎段等外植体在不同6-BA和TDZ激素组合中的愈伤组织诱导率、不定芽分化率和愈伤组织状态,结果表明:高浓度TDZ有利于愈伤组织的诱导,低浓度6-BA使愈伤组织松散,TDZ对不定芽的形成起到至关紧要的作用。不同外植体的愈伤组织诱导率依次为:子叶(100%)>组培苗茎段(98.54%)>下胚轴(92.56%)>根(50.71%)。组培苗茎段和下胚轴形成的愈伤组织具有再生能力,分化率分别为33.33%和10.52%。茎段伤口部位形成的愈伤组织更有利于不定芽的形成与分化,MSB5更适合组培苗茎段愈伤组织不定芽的分化。2.建立了高效的愈伤组织不定芽再生技术:水曲柳组培苗茎段在C12培养基(MSB5+30g/L 蔗糖+7g/L 琼脂+5mg/L 6-BA+8mg/L TDZ+2mg/L 甘氨酸+0.1mg/L IBA+5%椰子水)诱导愈伤组织及不定芽,愈伤组织和不定芽诱导率分别为99.15%和33.33%。添加2.4mg/L DNA去甲基化试剂5-氮胞苷(5-aza)可以提高不定芽诱导率,不定芽诱导率可以达到50.79%。添加0.15mg/L组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑霉素A(TSA)也可以提高不定芽诱导率,不定芽诱导率可以达到51.11%。3.提出茎段外植体的愈伤组织途径再生技术:诱导愈伤及不定芽的最适培养基为M SB5+30g/L 蔗糖+7g/L 琼脂+5mg/L 6-BA+8mg/L TDZ+2mg/L 甘氨酸+0.1mg/L IBA+5%椰子水+0.15mg/LTSA,30d后不定芽诱导率达51.11%。转入继代增殖培养基WPM+20 g/L蔗糖+7g/L琼脂+8mg/L6-BA,一个继代(30d)后增殖系数为4.28。将3～5cm长的健壮不定枝转入生根培养基WPM+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.4mg/L IBA+0.7mg/L NA A,20d后生根率为80.54%。炼苗后移栽到含有草炭土:蛭石=3:1的混合基质中,成活率达到90%左右。4.愈伤组织不定芽分化过程中激素含量、相关基因表达变化分析:水曲柳组培苗茎段愈伤组织形成过程中IAA、ZR、GA3参与愈伤组织形成,ZR参与不定芽的形成。Fm WIND1、FmYUC1、FmWOX5、FmREV、FmPLT3 参与了不定芽形成。5.初步探究了愈伤组织再生过程表观修饰和再生相关基因表达的关系。水曲柳茎段愈伤组织形成阶段DNA甲基化水平下降,不定芽形成阶段DNA甲基化水平再次回升。不定芽形成阶段HDAC酶活性随TSA浓度的升高而降低。6.克隆了愈伤组织形成和芽再生关键基因FmWIND1,并进行生物信息学分析。发现FmWIND1基因长度为990bp。蛋白质序列编码329个氨基酸,等电点为6.72,是一种不稳定的亲水蛋白,亚细胞位于细胞核中,在156～219位置有1个AP2保守结构域。构建FmWIND1蛋白系统进化树,发现FmWIND1与欧洲橄榄和芝麻WIND蛋白亲缘关系较近。通过qRT-PCR分析,FmWIND1基因在不同组织中表达量为:根>茎>花>叶,在受到伤口刺激后在12h内快速应答上升,并在芽再生后再次表达升高。