【背景】人细小病毒B19(Human parvovirus B19，简称B19病毒)是一种单链线状小DNA病毒，能导致多系统疾病，如自然流产、胎儿畸形、再生障碍性贫血危象、肾小球肾炎、关节炎等，严重者可致死。本实验室首次报道心脏发育畸形的胎儿心脏尸检标本及先天性心脏病(CHD)心肌组织标本中有较高的B19病毒DNA检测阳性率，提示B19病毒感染可能与部分CHD发病相关，接着国外研究还提示B19病毒感染可引起心肌炎、川崎病、冠状动脉病变等心血管疾病。值得重视的是，由于B19病毒不能常规培养分离和不能感染实验动物如鼠、狗和猪等，因此其感染导致上述疾病的机理尚未阐明。B19病毒基因编码的结构蛋白VP2蛋白包含在VP1蛋白中，VP1蛋白N末端的227个氨基酸叫做VP1独特区蛋白(VP1u蛋白)。既往研究将VP1u蛋白作为亚单位疫苗研究的候选分子，本实验室发现VP1u蛋白可导致BALB/c小鼠心脏病变，包括心肌纤维间隙增宽、肌丝崩解、线粒体空泡化等。这一结果提示须重新审视B19病毒VP1u蛋白的功能，并回答下列相关问题：B19病毒VP1u蛋白引起心脏病变的机制是什么？是病毒蛋白直接毒性作用造成组织损伤，还是其刺激机体产生的抗体导致心脏损害？其通过什么信号通路导致心肌损伤？其引起心肌病变与B19病毒致胎儿心脏水肿、流产、心脏畸形有无相关性？它是否强烈地告知B19病毒VP1u蛋白用于疫苗研究的不可能性？为此，本项目将用纯化的B19病毒VP1u蛋白和单克隆抗体(mAb)作用离体心肌细胞和鼠(包括孕鼠)，用光镜、电镜、免疫组织化学、流式细胞仪和信号通路分析等方法，研究心肌细胞结构、凋亡、细胞表面标志物、细胞因子、细胞粘附分子和信号通路变化。这将有助于揭示B19病毒感染的发病机制，也有助于对病毒蛋白毒性和免疫损伤机制的认识或致病相关通路的新发现，并进一步促进B19病毒致病机理及预防疫苗的研究。【目的】1.获得B19病毒VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb，为后续研究奠定基础。2.研究B19病毒VP1u蛋白对离体和整体动物心肌细胞结构、凋亡、相关细胞因子、细胞表面标志物和信号通路的影响，从病毒蛋白毒性、免疫损伤、信号通路改变方面探讨B19病毒VP1u蛋白致心肌病变的机制。3.研究B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏重量、结构、凋亡、细胞表面标志物、信号通路及胎鼠流产的影响，探讨B19病毒VP1u蛋白与心脏发育和胎鼠流产的关系。【方法】1. B19病毒VP1u蛋白纯化及mAb制备⑴根据已经构建的VP1u蛋白表达纯化体系获得B19病毒VP1u蛋白。⑵用B19病毒VP1u蛋白免疫小鼠，免疫后脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得鼠源性mAb。2. B19病毒VP1u蛋白对离体培养心肌细胞作用的研究⑴采用酶消化、差速贴壁和5-溴脱氧尿苷(5-Brdu)抑制法获得高纯度离体培养心肌细胞。⑵给予B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预离体心肌细胞，首先计算VP1u蛋白入心肌细胞率，然后，通过光镜和电镜观察心肌细胞结构，干化学分析法检测心肌酶谱和ELISA法定量检测细胞因子变化。⑶TUNEL免疫荧光法、流式细胞仪检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预离体心肌细胞导致心肌细胞凋亡情况。⑷免疫细胞化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预心肌细胞后细胞粘附分子ICAM-1(CD54)、VCAM-1(CD106)和E-selectin(CD62E)变化。⑸Western blot检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后离体心肌细胞NF-κB信号通路和p38MAPK信号通路变化。3. B19病毒VP1u蛋白致正常鼠心脏病变的研究⑴用B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射BALB/c小鼠，光镜和电镜观察心脏组织结构变化，干化学分析法检测心肌酶谱变化，ELISA法定量检测细胞因子变化。⑵TUNEL免疫荧光法、免疫组织化学法和流式细胞仪检测VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预鼠心脏中心肌细胞凋亡情况。⑶免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预鼠心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin变化。⑷原位分子杂交技术检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预鼠心肌细胞中NF-κB、PKC-α及PDGF-β变化。⑸根据实验结果提出B19病毒VP1u蛋白引起心肌病变的信号通路。4. B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响⑴用B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射BALB/c孕鼠，观察流产情况，采集胎鼠心脏组织，称重，光镜和电镜观察心脏组织结构。⑵TUNEL免疫荧光法和免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心脏中心肌细胞凋亡情况。⑶免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin变化。⑷原位分子杂交技术检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心肌细胞中NF-κB、PKC-α及PDGF-β变化。【结果】1. B19病毒VP1u蛋白纯化及mAb制备⑴获得分子量22kDa、浓度1.2mg/mL、纯度96.7%的B19病毒VP1u蛋白，并获得两株分泌抗B19病毒VP1u蛋白mAb的细胞株，分别命名4-H-5和5-B-9，两株mAb细胞株分泌抗体均为IgG2a，抗体稀释倍数为1:16000时检测结果仍为阳性，4-H-5抗体的效价高于5-B-9，纯化后抗VP1u蛋白mAb浓度分别是900μg/mL(4-H-5)和1110μg/mL(5-B-9)。2. B19病毒VP1u蛋白对离体培养心肌细胞作用的研究⑴通过酶消化法、差速贴壁法和5-Brdu抑制法得到离体培养心肌细胞，6~8h心肌细胞贴壁，12~16h出现不规律搏动，自发搏动频率40~80次/min。贴壁心肌细胞呈梭形，中心可见细胞核，每个细胞向外伸出数个突起，心肌细胞存活率82%。5~6d形成菊花状功能小体，此时搏动较规律，52.6±18.6次/min。⑵离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb共同干预组、抗VP1u蛋白mAb干预组电镜下发现细胞自噬。⑶离体心肌细胞实验中，BCA法检测细胞培养液中VP1u蛋白量，进入心肌细胞的VP1u蛋白量是0.036~0.468μg，统计学处理，P>0.05，各剂量组在不同时间点差别无统计学意义；P>0.05，各剂量组组间差别无统计学意义。ELISA法直接检测心肌细胞匀浆中VP1u蛋白量，进入心肌细胞VP1u蛋白量0.012~0.076μg，统计学处理，P>0.05，各剂量组在不同时间点差别无统计学意义；P>0.05，各剂量组组间差别无统计学意义。⑷离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞培养液中心肌酶谱与对照组比较，P>0.05，差别无统计学意义。⑸离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞培养液中IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β1与对照组比较，P>0.05，差别无统计学意义。⑹离体心肌细胞实验中，通过TUNEL免疫荧光和流式细胞分析技术，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞发生细胞凋亡。B19病毒VP1u蛋白干预组细胞凋亡率5.4%，B19病毒VP1u蛋白和抗B19病毒VP1u蛋白mAb共同干预组细胞凋亡率7.7%，抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞凋亡率15.5%。⑺离体心肌细胞实验中，免疫组织化学提示B19病毒VP1u蛋白刺激心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达增强。⑻离体心肌细胞实验中，PKC/p38MAPK信号通路和NF-κB信号通路参与B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞凋亡。3. B19病毒VP1u蛋白致正常鼠心脏病变的研究⑴整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组光镜下均发现心肌细胞间隙增宽，细胞核肿胀，核浆比例增高；电镜下均可见心肌细胞中线粒体聚集，细胞核稍缩小，核染色质致密并边集于核膜处。⑵整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组AST、CK、CK-MB、LDH和α-HBDB值行LSD-t检验，组间两两比较，P<0.05，干预组与对照组间差别有统计学意义。⑶整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β1值行LSD-t检验，组间两两比较，P<0.05，干预组与对照组间差别有统计学意义。⑷整体动物实验中，通过TUNEL免疫荧光、免疫组织化学和流式细胞分析技术，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞发生细胞凋亡。抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射组，细胞凋亡率最高(15.9%)。该凋亡过程中伴有抑制凋亡分子Bcl-2出现。⑸整体动物实验中，免疫组织化学提示B19病毒VP1u蛋白刺激心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达增强。⑹整体动物实验中，通过原位分子杂交技术在B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组检出NF-κB、PKC-α及PDGF-β。4. B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响⑴对胎鼠心脏影响研究中，实验期间有23只小鼠怀孕，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组均未见胎鼠流产。各组产仔数量进行组间方差分析，P>0.05，差别无统计学意义；各组胎鼠心脏重量进行组间方差分析，P>0.05，差别无统计学意义。⑵对胎鼠心脏影响研究中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb注射组光镜下均可见心肌细胞间隙增宽，胞质透明淡染，部分心肌细胞脂肪变性。电镜下VP1u蛋白注射组可见心肌细胞间隙增宽，细胞膜下空泡，可见次级溶酶体；VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb共同注射组、抗VP1u蛋白mAb注射组均可见线粒体聚集在增宽的心肌细胞间隙中，线粒体有空泡化。⑶对胎鼠心脏影响研究中，通过TUNEL免疫荧光和免疫组织化学，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导胎鼠心肌细胞发生细胞凋亡。⑷对胎鼠心脏影响研究中，免疫组织化学法在VP1u蛋白注射组和或抗VP1u蛋白mAb注射组心脏组织中检出微弱棕色信号提示有少量ICAM-1、VCAM-1和E-selectin。⑸对胎鼠心脏影响研究中，通过原位分子杂交技术在VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组检出NF-κB、PKC-α及PDGF-β。【结论】⑴获得B19病毒VP1u蛋白和两株分泌抗B19病毒VP1u蛋白mAb的细胞株，为后续B19病毒VP1u蛋白相关研究奠定了基础。⑵通过ELISA法检测心肌细胞匀浆中VP1u蛋白量和BCA法检测细胞培养液中VP1u蛋白量，结果提示VP1u蛋白没有进入心肌细胞内。⑶离体心肌细胞培养时，干预组心肌酶谱没有升高，而整体动物研究时，干预组心肌酶谱升高，提示VP1u蛋白并非直接破坏心肌细胞膜，可能与VP1u蛋白依赖分子拟态刺激机体产生自身抗体引起免疫性心肌损伤有关。⑷首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞凋亡。⑸心肌细胞发生凋亡过程中，伴有ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和Bcl-2等抑制细胞凋亡分子升高，提示抑制凋亡与促进凋亡的对抗随着时间变化而变化，为了阐明两者的相互关系，将进一步研究不同时间点相关分析。⑹首次揭示B19病毒VP1u蛋白致心肌细胞凋亡过程中包含有NF-κB信号通路和p38MAPK信号通路，需要相应信号通路抑制剂来进一步证实上述信号通路是否为主要信号通路。⑺本研究结果揭示B19病毒VP1u蛋白能引起胎鼠心脏水肿，但没有引起胎鼠死亡、流产和心脏发育畸形。