【摘 要】
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为了促进转基因大豆GE-J12及其加工食品尽快进入市场,本研究主要对抗除草剂转基因大豆新材料GE-J12进行纯度分析,纯合性分析以及分子特征检测,并建立了抗除草剂转基因大豆新材料GE-J12转化体的实时荧光PCR定量检测方法和微滴数字PCR精准定量检测方法。转基因大豆新材料GE-J12的分子特征研究是转基因安全评价的重点,更为其他转基因食品材料鉴定提供了依据。1.转基因大豆GE-J12和受体大豆J
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为了促进转基因大豆GE-J12及其加工食品尽快进入市场,本研究主要对抗除草剂转基因大豆新材料GE-J12进行纯度分析,纯合性分析以及分子特征检测,并建立了抗除草剂转基因大豆新材料GE-J12转化体的实时荧光PCR定量检测方法和微滴数字PCR精准定量检测方法。转基因大豆新材料GE-J12的分子特征研究是转基因安全评价的重点,更为其他转基因食品材料鉴定提供了依据。1.转基因大豆GE-J12和受体大豆Jack纯度分析采用研发者提供的纯度引物J12-5’F1和J12-T5’R1,对转基因大豆GE-J12和受体大豆Jack各100粒种子基因组DNA,进行普通PCR扩增。结果转基因大豆GE-J12扩增后均得到目的条带,转基因纯度为100%;受体大豆Jack扩增后均未得到目的条带,非转基因纯度为100%,符合GB4404.2标准要求,可以进行后续试验。2.转基因大豆GE-J12微滴数字PCR纯合性分析根据转基因大豆GE-J12的序列信息,设计合成纯合性引物/探针GE-J12-3-F1/R1/P1。根据农业部2031号公告-8-2013,合成大豆内标准基因Lectin的引物/探针。经检测10株单株数据结果均接近1,证明转基因大豆GE-J12是纯合材料。3.转基因大豆GE-J12的分子特征检测（1）外源插入片段全序列分析对普通PCR扩增目的产物进行Sanger测序,得到转基因大豆GE-J12外源插入片段4659 bp及左边界476 bp、右边界200 bp,插入片段全长为5347 bp与技术资料提供的全序列信息一致。进一步分析得到转基因大豆GE-J12的序列信息,得出该转基因大豆含有的目的基因GAT和G2-EPSPS以及调控元件CaMV 35S终止子、NOS终止子均为单拷贝插入,CaMV35S启动子为3拷贝插入,序列比对结果与技术资料提供的一致。（2）外源基因筛查经过普通PCR扩增筛查,得出转基因大豆GE-J12含有目的基因G2-EPSPS和目的基因GAT以及调控元件CaMV 35S启动子、CaMV 35S终止子、NOS终止子等。（3）外源插入片段拷贝数分析经微滴数字PCR和Southern杂交两种方法检测,得出转基因大豆GE-J12含有的调控元件CaMV 35S启动子拷贝数为3,CaMV 35S终止子、NOS终止子拷贝数为1,5’端和3’端旁侧序列拷贝数为1,目的基因G2-EPSPS和目的基因GAT的拷贝数为1,载体T-DNA在受体大豆为单拷贝插入。4.实时荧光PCR相对定量检测方法的建立确定了最佳引物/探针（TaqMan水解探针）GE-J12-5-F1/R1-P2,并作为后续试验的引物/探针;确定了引物和探针的终浓度分别为0.5 μmol/L和0.25μmol/L;确定了退火温度为58℃;通过特异性试验确定了引物/探针具有良好的特异性;在Bias和RSD均小于25%时,确定了检出限为0.032%,定量限为0.16%;标准曲线的线性方程 Y=-3.158X+36.784、Y=-3.132X+36.683、Y=-3.286X+37.113,决定系数在 R2 0.992、0.995、0.992,扩增的效率为 107.3%、108.6%、101.5%;经 5%、3%和 1%定值样品测试,测试样品与理论值的定量结果的平均Bias在2.15%～19.10%,重复试验间的拷贝数浓度的RSD在8.50%～17.32%之间,小于25%,定值结果较为准确。建立的实时荧光PCR相对定量检测方法适用于该转基因大豆的相对定量检测,为转基因大豆GE-J12的定量检测提供了新方法。5.微滴数字PCR定量检测方法的建立根据转基因大豆GE-J12序列信息设计了微滴数字PCR检测方法的引物/探针;确定了最佳引物/探针为GE-J12-3-F1/R1/P1;经过试验及结果分析,确定了引物和探针的终浓度分别为0.5μmol/L和0.25 μmol/L;确定了退火温度为58℃;确定了引物/探针对转基因大豆GE-J12具有特异性;转基因大豆GE-J12转化体的测量值拷贝数浓度Y与预期值拷贝数浓度X间,线性关系良好,线性方程分别为Y=1.051X-24.983,决定系数R2为0.999,;本方法在Bias和RSD均小于25%的情况下,检出限为0.04%,定量限为0.16%;并且5%、1%、0.1%的测试样品与真实值的定值结果的Bias在0.80%～13.39%之间,小于25%,拷贝数浓度重复试验间的RSD在1.03%～14.37%之间,小于25%,定值样品的重复性测量结果稳定、可靠。建立的微滴数字PCR绝对定量检测方法适用于该转基因大豆的绝对定量检测。
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