恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，在各种疾病所致的死亡中，恶性肿瘤现已成为主要病因。以免疫治疗为基础发展而来的生物治疗日益受到重视，显示出良好的应用前景，为肿瘤治疗带来了新的希望。 理想的肿瘤免疫治疗策略是激发机体T细胞为基础针对各种肿瘤排斥抗原的细胞免疫应答。近来研究发现Exosomes具有较好的抗肿瘤作用，是一种新型疫苗。Exosomes是小的膜性囊泡，可由许多细胞分泌，如树突状细胞、肿瘤细胞等。目前研究认为：肿瘤细胞来源的Exosomes(Tumor-derived exosomes，TEXs)能诱导强大的抗肿瘤免疫反应，产生有效的免疫保护性和治疗性效应，并且这种抗瘤效应能跨越组织和MHC限制性。另外，由于肿瘤细胞来源的Exosomes含有许多肿瘤细胞所共有的共同抗原，是一种具有广泛应用价值的新型肿瘤疫苗。同时Exosomes具有非细胞结构、未经基因的修饰、对机体潜在危害作用小、制备简单易行等优点，因而有理由相信，肿瘤细胞来源的Exosomes代表了一种天然的、全新的肿瘤疫苗，将成为研究新型肿瘤生物治疗制剂和肿瘤疫苗的新方向。 舌癌是最常见的口腔恶性肿瘤，生存率较低。与其他恶性肿瘤一样，舌癌患者也大都存在局部免疫缺陷的问题，因此我们设想从免疫学角度去研究治疗舌癌的有效方法。我们大胆设想，舌癌细胞也会分泌exosomes，而且也同样具有抗肿瘤活性，那么我们就可以利用exosomes来治疗舌癌，为舌癌乃至其他口腔恶性肿瘤的治疗开辟新途径。本研究从舌癌细胞系Tca8113培养上清中分离、提纯及鉴定exosomes，并初步探讨其抗肿瘤作用及相关机制，为进一步深入研究其抗肿瘤作用乃至临床运用奠定基础。研究目的首先研究舌癌Tca8113能否分泌exosomes，若能分泌，则进一步研究影响exosomes产生的可能因素，并初步观察其是否具有抗肿瘤效应，探讨其抗肿瘤的可能机制。 第一部分 Tca8113来源exosomes的分离、纯化及鉴定 1 方法: 1．1 Tca8113来源exosomes的分离、纯化：收集Tca8113细胞培养上清500ml，通过连续离心及超滤法分离，纯化出exosomes。 1．2 exosomes的鉴定：通过透射电镜、考马斯亮蓝(Commassie Blue)染色、蛋白印记(Western blot)等证明所获得物为exosomes。 2 结果: 1．1 Tca8113来源exosomes的分离、纯化：通过一系列的超滤、离心，最终分离、纯化出exosomes。一般而言，从500ml Tca8113培养上清(约5×10<8>个细胞)纯化到约100μg的exosomes。 2．2 exosomes的鉴定：透射电镜及western blot表明，所获得物即为exosomes。 3 结论: 3．1 Tca8113能分泌exosomes。 3．2 Tca8113来源exosomes含有HSC70、TSG 101、MAGE、MHC class Ⅰ等蛋白。 第二部分 exosomes诱导CTL体外抗肿瘤效应研究 1 方法: 1．1 DC细胞及外周T淋巴细胞分离培养：取外周静脉血，密度梯度离心法分离单核细胞，利用细胞因子GM-CSF和IL-4联合培养的方式，诱导单核细胞分化为不成熟的DC。 1．2 DC的致敏：在DC培养液中分别加入exosomes，不成熟的DC摄取抗原后，成为成熟的DC。 1．3 特异性CTL的产生：从外周静脉血中获得T淋巴细胞，加细胞因子IL-2培养使之增殖，并与致敏的DC混合培养，使T淋巴细胞活化为CTL细胞。 1．4 乳酸脱氢酶法测细胞杀伤效应：分3组：其中T1为未用肿瘤抗原负载DC诱导的CTL；T2：负载exosomes的DC诱导CTL；T3：单纯培养的T细胞组。以上述三组T细胞为效应细胞，Tca8113细胞为靶细胞。按照乳酸脱氢酶试剂盒说明书，检测负载exosomes的DC活化的CTL的对Tca8113的杀伤效果。 1．5 ANNEXIN V和PI检测：将负载exosomes的DC诱导CTL与Tca8113细胞(约1×10<6>个)以20：1加入24孔板共培养，约培养8h。并以约等量的。Tca8113细胞为阴性对照组。在上述两组细胞加入ANNEXIN V和PI，然后用流式细胞仪检测。 2 结果: 2．1 培养24h后出现少量悬浮细胞，但大部分细胞仍然贴壁生长：培养48h后，细胞出现不规则形态，同时悬浮细胞增多：培养3d后细胞表面伸出毛刺样突起，且数目明显增多，体积增大，呈集落样生长：培养7d后，集落分散，细胞大部分呈悬浮生长，分布较均匀，具有典型的树突状突起。DC的表型检测，CD1a的阳性表达率为5.53﹪，HLA-DR的表达率为21.56﹪，其表面共刺激分子表达率为CD801.12﹪，CD86的表达率为56.79﹪，此时的DC处于非成熟状态。负载抗原后检测DC的表型，DC高表达抗原呈递分子和共刺激分子，说明经exosomes冲击后，可以生成成熟DC。 2．2 Tca-8113细胞与负载exosomes的DC诱导的CTL混合共培养12h后，可以观察到T细胞有围绕癌细胞生长的趋势，癌细胞内颗粒增多。 2．3 乳酸脱氢酶法测细胞杀伤效应实验结果：①效靶比为10：1时，负载exosomes的DC诱导的CTL、未用exosomes负载的DC诱导的CTL及加IL-2培养的T细胞对。Tca-8113细胞的杀伤率，分别为(40.18±4.36)﹪、(12.46±1.75)﹪和(8.56±1.54)﹪；效靶比为20：1时，上述三组分别为：(50.27±4.58)﹪、(13.53±2.01)﹪和(10.22±1.86)﹪；效靶比为40：1时，上述三组分别为：(65.04±4.70)﹪、(14.32±2.21)﹪和(11.34±2.01)﹪。②负载exosome的DC诱导的CTL与未用exosomes负载DC诱导的CTL及加IL-2培养的T细胞的杀伤率相比较，差异显著(P<0.01，表1)。提示负载exosomes的DC诱导的CTL对Tca-8113细胞有明显的杀伤活性。 2．4 ANNEXIN V和PI检测结果：阴性对照组(单纯Tca8113细胞组)：AnnexinV=7.4﹪，PI=4.2﹪；实验组(负载exosomes的DC诱导CTL+Tca8113细胞组)：Annexin V=43.8﹪，PI=12.8﹪。表明负载exosomes的DC诱导CTL对肿瘤细胞有一定的杀伤力，且其杀伤原理，既有细胞膜破裂死亡，又有通过诱导细胞凋亡的方式杀伤细胞，而且后者是主要的方式。 3 结论: 3．1 从人外周静脉血分离单核细胞，经细胞因子GM-CSF和IL-4联合培养后，可分化为不成熟的DC，DC在负载exosome后可成熟，成熟的DC可使CD3<+>CD8<+>阳性(CTL)的百分比提高。 3．2 肿瘤细胞培养上清液中分离出的exosomes，负载到DC上后，可以活化T细胞，使之成为抗原特异性的CTL，并具有特异性的杀伤肿瘤细胞的功能，说明exosome中含有肿瘤特异性抗原，为口腔肿瘤的免疫治疗开拓了新的途径。