论文部分内容阅读
肾癌是严重危害人类生命和健康的最常见肿瘤之一，其中绝大多数为肾细胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)，起源于近曲小管的上皮细胞，为泌尿系统常见的恶性肿瘤，占肾恶性肿瘤的75％。因为肾细胞癌缺乏特异的早期症状，当患者出现典型的临床症状时往往已处于中晚期，临床上虽然采取积极的手术切除和辅助治疗，但疗效不佳，因此迫切需要寻找新的治疗方法以改善患者的预后。 研究表明恶性实体肿瘤的生长与转移必须依赖新生血管持续不断的为其提供营养。肿瘤血管的生成受多种促血管生成因子的调节，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)，转化因子β1(TGFβ1)等，其中VEGF起主要作用，它具有强烈的促血管内皮细胞生长增殖的作用。研究表明大多数实体肿瘤中表达或过量表达VEGF，而肾癌作为一种高度血管化的实体瘤，大量资料显示，血管生成是肾癌生长，侵袭和转移的关键，人肾癌组织VEGF高表达，而且与肾癌的分级与分期密切相关。因此通过影响VEGF的表达从而干预肾癌的生长将是一种有效的方式。其中在基因水平干预VEGF的转录和翻译的反义基因疗法更有前瞻性研究价值。为此我们通过构建反义VEGF基因的pcDNA3.1真核表达载体并将其转染入肾癌细胞中，观察人反义VEGF基因对肾癌细胞VEGF表达的影响及生长的影响。为肾癌的基因治疗提供实验依据。 材料和方法： 1．RT-PCR方法克隆人VEGF基因：从人胶质瘤组织中提取总RNA；按照反转录试剂盒的说明合成VEGFcDNA；PCR反应，引物1为5’-CG GAA TTC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GC-3’引物2为5’-CG AAG CTT TCA CCG CCT CGC CTT GTC ACA郑州大学2003年研究生毕业论文人反义vEGF荃因对肾癌细胞v印F表达和生长形响的研究TC一3‘，引物1与引物2序列分别加有EeoRI和Hind 111内切酶位点。将RT一PCR产物与pcDNA3.1各自分别用EcoRI和Hindm内切酶进行双酶切反应，然后进行连接反应，将VEGF基因定向克隆于pcDNA3.1真核表达载体，此载体含CMV启动子和氨基糖昔磷酸转移酶基因(G4 18)。转化感受态大肠杆菌DHSQ，挑取阳性载体克隆，进行酶切鉴定以及基因测序检测反义真核表达载体是否构建成功。 2.培养人肾癌786一0细胞，肾癌细胞株786一0细胞生长于RMPI 1640培养基，其中含1既FCS(V/V)，培养于5%C02(V/V)，37℃细胞培养箱中。当细胞处于对数生长期时，利用脂质体Lipofe。t胡INE分别将pcDNA3.1反义VEGF真核表达载体和peoNA3.l转染入人肾癌786一0细胞。分别命名为786一0一(antisens)VEGF组和786一0一PC组，未转染细胞命名为786一0。在G418浓度为700“g/ml的RMPll640培养基(含10%FCS)筛选巧天左右，786一O组细胞全部死亡。786一O一 (ant 1 Sens。)VEGF组和786一0一PC组均有细胞克隆形成。挑取两种细胞的阳性克隆，将两种阳性克隆细胞分别扩增培养。以300 pg/m1浓度为维持浓度。 3.利用以p一actin为内对照，定量RT一PCR方法在转录水平检测786一0- (antisense)VEGF组、786一0一PC组和786一0组这三组细胞VEGFmRNA表达 4.制备细胞爬片，利用免疫组化方法(SP法)在蛋白水平检测786一0- (ant 1 sense)VEGF组、786一0一PC组和786一0组这三组细胞VEGF表达 5.利用MTT法酶联免疫检测仪在波长492nm测786一0一(antisense)VEGF组、786一0一PC组和786一0组这三组细胞的吸光度，绘制三组细胞生长曲线。 6.统计学分析:采用SPSS10.0软件包进行ANOV统计分析。 结果:克隆出人VEGF基因，经酶切和DNA测序鉴定，证实反义VEGF基因的peDNA3.l真核表达载体构建成功:786一0一(antisense)VEGF组VEGFmRNA的表达受到抑制，明显低于786一0一PC组和786一0组VEGFmRNA的表达(P(0.01)，而786一O一PC组VEGFmRNA的表达没有受到影响，与786一0组相比二者无统计学差异(P>0.05):786一。一(antisense)vEGF组vEeF蛋白的表达明显降低，低于786一0一PC组和786一0组VEGF蛋白的表达(P(0.01)，而786一0一PC组和786一0组vEGF蛋白的表达二者无统计学差异(P>0.05);786一0一(antisense)VEGF组肾癌细胞生长受到抑制，同786一O一PC组和786一0组肾癌细胞生长相比786一0-(ant isense)VEGF组肾癌细胞生长明显减慢。郑州大学2003年研究生毕业论文人反义vE(:F基因对肾癌细胞v氏F表达和生长影响的研究 结论:结果显示本实验成功构建反义vEGF基因的pcDNA3.1真核表达载体;人反义VEGF基因可明显降低肾癌细胞VEGF的表达;明显减慢肾癌细胞的生长。为进一步对肾癌基因治疗的研究提供了一定的实验依据。