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目的脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad gene，FHIT）作为抑癌基因与肝癌的发生有关，且在肝癌细胞系Hep3B中存在FHIT基因染色体、mRNA和蛋白的异常。本研究拟探讨外源性人FHIT的高表达对人肝癌细胞Hep3B生长的影响。材料和方法1．用免疫组织化学S-P法检测46例肝癌及相应癌旁组织中脆性组氨酸三联体（FHIT）基因蛋白的表达，标本均为2001～2003年同济医院病理科存档外科手术标本。其中男34例女12例，平均年龄56.3岁（18～72岁）。肿瘤平均直径（6.4±3.1）cm，其中≤5cm有9例，＞5cm有37例；甲胎蛋白＞20ug／1有42例，≤20ug／1有4例；合并乙型肝炎病毒感染的有40例，未感染者6例；所有肿瘤标本经病理证实属高分化者14例，中分化者20例，低分化者12例；有包膜的5例，无包膜的41例；经手术证实有门静脉癌栓8例（均属低分化型），无癌栓38例；合并肝硬化35例，无肝硬化11例。另选10例因胆道手术切除的部分正常肝组织为正常对照组织。参考近期国外文献方法观察FHIT蛋白的阳性强度和阳性率，采用x2检验分析FHIT表达与临床资料的相互关系。另采用免疫组织化学S-P法和图像分析技术检测了46例人肝癌组织及癌旁组织和10例正常肝组织中FHIT和PTEN基因蛋白的表达。探讨脆性组氨酸三联体（FHIT）基因和PTEN基因在原发性肝细胞癌（简称肝癌）中的表达及其与临床病理因素的关系。2．构建一个包含人脆性组氨酸三联体（FHIT）基因的真核表达载体pcDNA3.1（+）／FHIT，体外转染人肝癌细胞Hep3B，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western印迹法分别检测目的基因不同水平的表达，通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术检测细胞转染前后的细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化。3．裸鼠皮下移植瘤实验：用Lipofectamine2000介导将2μg pcDNA3.1（+）和pcDNh3.1（+）／FHIT质粒分别转染Hep3B细胞，于转染后48h用G418（500mg／L）进行筛选14天，可见有抗性克隆形成，继续扩大培养获得混和克隆，用此混和克隆细胞进行裸鼠背部皮下注射，试验分2组，每组6只裸鼠，用于接种转染pcDNA3.1（+）／FHIT质粒和空质粒pcDNA3.1（+）的Hep3B细胞，每只接种细胞数为1×106个，观察各组试验动物成瘤情况。于接种后每隔3天观察一次肿瘤的大小，21天后处死动物，剥离肿瘤，测量肿瘤大小并称瘤重，根据公式V=π／6W2×L（W为宽度，L为长度）计算瘤体积，以接种转染空载体的细胞组为对照，结果进行统计学分析。结果1．10例正常肝组织中FHIT基因表达均呈强阳性（10／10，100.00％），46例癌旁组织FHIT蛋白表达呈不同程度阳性：阳性17例（36.96％）；强阳性29例（63.04％）。正常肝组织与癌旁组织中均无FHIT蛋白的丢失。46例肝癌组织中20例（43.48％）FHIT蛋白丢失（表达阴性），20例表达为阳性（43.48％），6例表达为强阳性（13.04％）。肝癌组织中FHIT基因表达水平与肝癌大小、甲胎蛋白高低、是否有无包膜、是否合并乙肝病毒感染及肝硬化无明显关系；而与肿瘤组织分化有密切关系（x2=6.619；P=0.045），与是否有门静脉癌栓也有关（x2=4.336；P=0.037）。46例肝癌组织中FHIT和PTEN蛋白免疫组化阳性反应颗粒的平均光密度分别为（0.1339±0.3864，0.1534±0.1562），均明显低于相应癌旁组织（0.2051±0.5372，0.3271±0.2371）和正常组织（0.2289±0.7589，0.3753±0.0519）的水平（P＜0.05）；FHIT、PTEN与肝癌的病理分级、合并门静脉癌栓有密切关系。2．质粒pcDNA3.1（+）／FHIT构建成功，转染pcDNA3.1（+）／FHIT后，Hep3B-FHIT细胞FHIT-mRNA阳性，为400bp条带，而空载体转染细胞Hep3B-C和亲本细胞Hep3B未见此条带的表达；Hep3B-FHIT细胞中有17kD的FHIT蛋白表达，而空载体转染细胞Hep3B-C和亲本细胞Hep3B未见FHIT蛋白表达；FHIT基因转染细胞Hep3B-FHIT较空载体转染细胞Hep3B-C和亲本细胞Hep3B的生长速度明显减慢，尤其是达到对数生长期后更加明显，差异有显著性（P＜0.05）；流式细胞结果表明Hep3B-FHIT细胞G2／M期及S期比例明显下降，G0／G1期比例明显增加，凋亡细胞率也明显高于对照组和空质粒转染组（P＜0.05）。3．动物试验结果显示，所有试验动物均有大小不等的肿瘤生成，转染pcDNA3.1（+）／FHIT的细胞所形成的肿瘤重量和体积分别为（0.398±0.244）g和（408±268）mm2，而转染空载体pcDNA3.1（+）的细胞所形成的肿瘤重量和体积分别为（0.763±0.193）g和（829±271）mm2，两组相比差异均有显著性（t检验，p分别为0.017和0.022）。结论1．FHIT基因蛋白在正常肝组织及癌旁组织均为阳性表达，显著高于在肝癌中的阳性表达。FHIT基因蛋白的丢失与肿瘤是否有门静脉癌栓、肿瘤组织分化程度明显相关，与肿瘤大小、有无包膜、甲胎蛋白是否阳性、是否感染乙型肝炎病毒、是否合并肝硬化等因素均无明显的相关性。FHIT基因蛋白缺失在肝癌组织中是频发事件。FHIT基因蛋白在肝癌中缺失与肝癌临床表现及预后的关系，尚须大量研究证实。另FHIT和PTEN基因蛋白缺失在肝癌组织中是频发事件。FHIT和PTEN与肝癌的病理分级、合并门静脉癌栓有密切关系。2．FHIT基因通过诱导肿瘤细胞Hep3B发生凋亡并导致其发生G1期阻滞在肿瘤基因治疗方面发挥作用。3．pcDNA3.1（+）／FHIT能降低Hep3B细胞的成瘤能力，抑制移植瘤生长。