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目的:本课题采用已故“国医大师”张镜人教授经验方——至真方水提物体外干预人结肠腺癌耐长春新碱细胞HCT-8/VCR，观察至真方对HCT8/VCR细胞多药耐药的逆转作用，并从Akt/COX-2/P-gp信号通路探讨至真方逆转HCT-8/VCR细胞多药耐药的可能取效机制。 方法:(1) MTT法鉴定HCT-8/VCR细胞的多药耐药性;(2) MTT法检测100ug/mL至真方水提物对HCT-8/VCR细胞的耐药逆转作用;(3) FITC-AnnexinⅤ/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况;(4) Western blot检测细胞中Akt、p-Akt、COX-2、P-gp蛋白表达情况;(5)荧光定量PCR(RT-PCR)检测细胞中Akt、COX-2、MDR1基因表达情况。 结果: 第一章至真方对HCT-8/VCR细胞多药耐药的逆转作用 1.HCT-8/VCR细胞对4种化疗药物长春新碱(VCR)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CDDP)、紫杉醇(TAXOL)有不同程度的耐药性，其耐药指数分别为50.753、7.822、4.979、22.310。 2.100μg/mL的至真方干预HCT-8/VCR细胞后，能增加其对不同化疗药物VCR、5-Fu、CDDP、TAXOL的敏感性，各化疗药物的半数抑制浓度IC50明显下降，分别从(51.022±2.540)μg/mL下降至(7.194±0.203)μg/mL(P＜0.01)，(5.251±0.163)μg/mL下降至（1.154±0.104）μg/mL（P＜0.01），（6.306±0.576）μg/mL下降至（3.307±0.419）μg/mL（P＜0.05），（15.007±1.013）μg/mL下降至（1.927±0.640）μg/mL(P＜0.01)，逆转倍数分别为7.902、4.552、1.907、7.789。LY294002（PI3K/Akt特异性抑制剂）联合各化疗药物后，使VCR、5-Fu、CDDP、TAXOL的IC50值均有不同程度的下降(P＜0.05)，其逆转倍数分别为6.396、3.744、2.028、5.833。 3.至真方不同浓度（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）组、LY294002阳性对照组细胞的凋亡率分别为(18.633±1.644)％、(25.400±1.277)％、(34.233±1.662)％、(22.467±1.850)％，各组均明显高于阴性对照组(12.500±1.400)％(P＜0.01)。其中50μg/mL、100μg/mL至真方组的细胞凋亡率明显高于LY294002阳性对照组(P＜0.05)。 4.HCT-8/VCR细胞中P-gp蛋白相对表达量为（1.078±0.048），较HCT-8细胞的(0.101±0.017)明显升高(P＜0.01)。 5.至真方不同浓度（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）组、LY294002阳性对照组P-gp蛋白相对表达量分别为(1.208±0.085)、(0.914±0.044)、(0.719±0.084)、(0.681±0.042)，各组P-gp蛋白相对表达量均较阴性对照组(1.527±0.069)明显下调(P＜0.05)。其中100μg/mL至真方组与LY294002阳性对照组的P-gp蛋白相对表达量比较无显著差异(P＞0.05)。 第二章从Akt/COX-2/P-gp信号通路研究至真方的作用机制 1.HCT-8/VCR细胞中Akt、p-Akt、COX-2、P-gp蛋白相对表达量分别为(0.837±0.018)、(1.180±0.108)、(0.979±0.034)、(1.366±0.084), HCT-8细胞中Akt、p-Akt、COX-2、P-gp蛋白相对表达量分别为(0.805±0.042)、(0.335±0.021)、(0.109±0.012)、(0.138±0.021)。HCT-8/VCR细胞中p-Akt、COX-2、P-gp蛋白表达均比HCT-8细胞明显升高(P＜0.05)，而两细胞中Akt总蛋白表达无明显差异(P＞0.05)。 2.分别以HCT-8细胞中Akt、COX-2、MDR1基因相对表达量为1，HCT-8/VCR细胞中Akt、COX-2、MDR1基因相对表达量分别为(1.094±0.115)、(2.033±0.344)、(2.762±0.299)。HCT-8/VCR细胞中COX-2、MDR1基因相对表达量均比HCT-8细胞明显升高(P＜0.05)，而两细胞中Akt基因相对表达量无明显差异(P＞0.05)。 3.阴性对照组(HCT-8/VCR)、LY294002组（PI3K/Akt特异性抑制剂）、NS-398（COX-2抑制剂）组的Akt蛋白相对表达量分别为(1.310±0.110)、(1.230±0.041)、(1.227±0.041)，各组无显著差异（P＞0.05）;LY294002组的p-Akt、COX-2、P-gp蛋白相对表达量分别为(0.354±0.044)、(0.561±0.066)、(0.955±0.117)，与阴性对照组(1.098±0.076)、(1.127±0.080)、(1.770±0.096)相比均明显下调(P＜0.05); NS-398组的p-Akt蛋白相对表达量为(1.030±0.028)，与阴性对照组无明显差异(P＞0.05），COX-2、P-gp蛋白相对表达量分别为(0.431±0.043)、(0.740±0.035)，均明显低于阴性对照组(P＜0.01)。 4.分别以阴性对照组(HCT-8/VCR)中Akt、COX-2、MDR1基因相对表达量为1，LY294002组Akt、COX-2、MDR1基因相对表达量分别为（0.997±0.107）、（0.413±0.105）、（0.409±0.220），其Akt基因相对表达量与阴性对照组相比无明显差异(P＞0.05)，COX-2、MDR1基因相对表达量分别与阴性对照组相比均明显减少(P＜0.05);NS-398组Akt、COX-2、MDR1基因相对表达量分别为（1.011±0.094）、（0.955±0.139）、(0.443±0.176)，其Akt、COX-2基因相对表达量与阴性对照组相比均无明显差异(P＞0.05)，MDR1基因相对表达量与阴性对照组相比明显下调（P＜0.05）。 5.阴性对照组(HCT-8/VCR)、至真方(100μg/mL)组、至真方(100μg/mL)联合IGF-1组的Akt蛋白相对表达量分别为(0.890±0.026)、(0.874±0.031)、(0.878±0.028)，组间无显著差异(P＞0.05);至真方组的p-Akt、COX-2、P-gp蛋白相对表达量分别为(0.380±0.019)、(0.337±0.024)、(0.372±0.038)，与阴性对照组相比(0.720±0.011)、(0.849±0.022)、(1.312±0.030)均明显下调(P＜0.05);至真方联合IGF-1组的p-Akt、COX-2、P-gp蛋白相对表达量分别为(0.630±0.008)、(0.609±0.043)、(0.924±0.045)，均较单用至真方组有所回升(P＜0.05)。 6分别以阴性对照组(HCT-8/VCR)中Akt、COX-2、MDR1基因相对表达量为1，至真方（100μg/mL）组的Akt、COX-2、MDR1基因相对表达量分别为(0.369±0.157)、(0.546±0.113)、(0.421±0.174)，均较阴性对照组明显下调(P＜0.05);至真方（100ug/mL）联合IGF-1组的Akt、COX-2、MDR1基因相对表达量均较单用至真方组回升(P＜0.05)，分别为(0.715±0.179)、(0.805±0.076)、(0.698±0.068)。 结论: 1.至真方水提物能有效改善HCT-8/VCR细胞的多药耐药性，并增加化疗药物诱导的细胞凋亡。 2.至真方逆转HCT-8/VCR细胞多药耐药的机制可能是通过抑制Akt磷酸化，下调COX-2的表达，进而减少MDR1/P-gp的表达。