脑心通对大鼠大脑中动脉闭塞模型治疗机制的研究

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研究目的:1.磁共振弥散加权成像(DWI)和灌注加权成像(PWI)联合应用,动态观察大鼠脑梗死区的组织灌注及脑梗死体积变化情况。侧面评价脑心通治疗脑梗死的疗效。2.采用longa Zea线栓法进行大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的制备,给予脑心通治疗后,测定脑组织中TNF-α、MMP-9、NF-κB m RNA水平和TNF-α、MMP-9、NF-κB蛋白表达水平,探讨脑心通对脑梗死的治疗作用的机制。3.大鼠MCAO后,测定脑组织中AQP-4 m RNA水平和蛋白表达水平,测定缺血脑组织干湿重百分比,探讨脑心通对脑缺血大鼠模型脑水肿和AQP-4表达水平的影响。研究方法:1.实验动物分组与给药:所有动物实验过程均符合《实验室动物使用与爱护指南》规定。健康SD雄性大鼠,体重200~220g之间,在人工控制温度与昼夜节律的环境中饲养,大鼠自由饮水与饮食。所有大鼠随机分为(11)假手术组:只做颈部手术,不插入线栓;(12)模型对照组:结扎血管后予以生理盐水给药;(13)脑心通治疗组:结扎血管后给予脑心通于缺血后30min给药。每组大鼠分别按12h、1d、3d、5d、7d处死时间点分为5个亚组,每个亚组6只大鼠。给药途径:将脑心通胶囊内的药物粉末用蒸馏水溶解,稀释成0.05g/ml浓度备用。脑心通组大鼠于术后给予步长脑心通溶液(0.45g/kg·d)灌胃(依据前期实验基础);假手术组和模型对照组大鼠给予和脑心通组相等容积的生理盐水灌胃。2.动物模型制备:采用Zea Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,大鼠清醒后采用Bederson5分评分法判断大鼠是否造模成功,评分≥2分即为造模成功。假手术组大鼠仅结扎颈部血管而不需插入线栓。3.MRI检查方法:分别于0.5d、1 d、3 d、5 d、7 d扫描磁共振,采用3.0T超导磁共振成像系统,大鼠专用线圈,大鼠经水合氯醛(0.35g/kg)麻醉后,采用俯卧位,行头颅冠状位扫描,层厚2 mm,层间距0 mm,层数11,观察脑梗死区域变化情况。4.脑组织中AQP-4、TNF-α、MMP-9和NF-κB m RNA的检测:取出脑组织后,用预冷的生理盐水冲洗后去除小脑和枕叶。取梗塞病灶周围脑组织约100mg,放入玻璃匀浆器中,加入Trizol,提取总RNA,在M-MLV逆转录酶作用下合成c DNA,再以c DNA为模板进行实时荧光定量PCR,检测其相对表达量。5.Western Blot法检测脑梗死灶周围脑组织中目的蛋白的表达水平:使用预冷的裂解液对各组大鼠脑组织进行裂解,按蛋白提取试剂盒说明书操作提取蛋白,测定蛋白浓度后,经SDS-PAG(10%分离胶、5%浓缩胶)凝胶电泳将蛋白分离开,再经过转膜电泳后蛋白转移到PVDF膜上。带有蛋白的PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭,加入配制好的一抗在37℃孵育2~4h或者4℃过夜;用TBST溶液洗膜3次后,加入配制好的二抗在37℃孵育1h。TBST洗膜3次后用化学发光液滴满膜上,在凝胶成像系统经暗室曝光,并拍照保存。用图像分析系统对电泳条带进行分析,将各条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为蛋白表达的相对值。6.统计学分析:采用SPSS 16.0系统软件包进行统计学分析,所有计量资料用均数±标准差(x±S)表示。两样本均数比较采用Student-t检验(双尾),多组剂量资料采用单因素方差分析(One-Way Analysis of Variance,One-Way ANOVO),P<0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.磁共振检查结果:随着治疗时间延长,模型组脑梗死体积变化不明显;脑心通治疗组脑梗死体积较模型对照组减小,差异有统计学意义(P<0.05)。2.脑梗死大鼠脑组织的TNF-α、MMP-9和NF-κB m RNA的表达水平:与假手术组相比较,模型对照组TNF-α、MMP-9和NF-κB m RNA表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组相比较,脑心通治疗组大鼠脑组织TNF-α、MMP-9和NF-κB m RNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.脑梗死大鼠脑组织的TNF-α、MMP-9和NF-κB蛋白表达水平:与假手术组相比较,模型对照组TNF-α、MMP-9和NF-κB蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组相比较,脑心通治疗组大鼠脑组织TNF-α、MMP-9和NF-κB蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.脑梗死模型大鼠脑水肿情况:与假手术组相比较,模型对照组大鼠脑组织AQP-4表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组相比较,脑心通治疗组大鼠脑组织AQP-4表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。脑组织含水量测定,脑心通治疗组较模型对照组脑组织含水量减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.脑心通对大鼠脑梗死有具有治疗作用,脑梗死体积较模型对照组减少。2.脑心通可以降低MCAO大鼠脑组织的AQP4、TNF-α、MMP-9和NF-κBm RNA水平,以及降低脑梗死组织周围TNF-α、MMP-9和NF-κB的蛋白表达量,减轻缺血后脑组织的炎症反应,保护脑组织。3.脑心通可以改善大鼠缺血后的神经功能缺损程度,减轻脑水肿程度以防止进一步脑损伤。
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