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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球性公共卫生问题,核苷类似物是目前治疗慢性乙肝的重要药物,但长期使用核苷类似物易发生耐药,耐药已成为乙肝抗病毒治疗中的重要热点问题。耐药现象的一个重要原因是HBV逆转录酶(RT)发生耐药突变,RT特定突变与耐药有确定关系。研究HBV耐药突变,很重要的一环是临床病毒株的体外表型分析。由于缺乏有效的HBV体外感染模型,现有HBV体外表型分析主要依赖重组HBV DNA体外转染系统。在这种背景下,一种可支持HBV体外复制的HBV DNA重组体就显得十分关键了。体外可复制的HBV DNA重组体至少需包含1.1倍以上的HBV基因组,限于HBV基因组的松弛环状特殊结构,及其开放读码框的高度重叠性,构建体外可复制重组体殊为困难。本研究建立了一种新策略,可以用来构建HBV1.1×基因组重组体。利用该策略,我们研究了RT S246T变异对HBV Entecavir体外敏感性的影响,以及RT N118H变异对Adefovir体外敏感性的影响。目的:建立一种构建HBV 1.1×全基因组重组体的新策略,利用该策略,分析临床样本中含有特定变异的病毒株对核苷类药物的体外敏感性。方法:1.以片段置换反应(Fragment Substitution Reaction, FSR)为核心,建立HBV 1.1×全基因组重组体构建新策略;本课题由国家高技术研究发展计划(2007AA02Z494)及国家自然科学基金资助(30972583 ).2.选择一例Entcavir治疗反应不佳的患者,分离其血清HBV DNA,构建含有RT S246T变异的HBV1.1倍体,转染HepG2细胞,进行体外ETV药敏分析;3.选择三例Adefovir治疗反应不佳的患者,分离其血清HBV DNA,构建含有RT N118H变异的HBV1.1倍体,建立稳定复制HBV细胞系,进行体外ADV药敏分析。结果:1.片段置换反应(FSR)可以有效地将DNA片段插入载体目标位置。当待替换片段与被替换片段同源性较高时,FSR高效且简便;2、利用片段置换反应构建的HBV 1.1×全基因组重组体均可支持HBV体外复制;3.含有RT S246T变异的HBV在体外的ETV IC50为0.99±0.09nM,与野生株相比,差异不明显;4.含有RT N118H变异的HBV在体外的ADV IC50为0.076±0.010μM,与野生株相比,无显著差异。结论:我们成功建立了一种新的分子克隆方法,即片段置换反应(FSR),其优点是可以绕过酶切连接步骤,将DNA片段插入载体。FSR方法在很多情况下(例如没有合适的酶切位点时),较传统酶切链接克隆方法更为灵活有效,由于这一特点,该方法在分子生物学研究方面有广泛应用前景。基于FSR,我们发展了一种新的体外可复制HBV1.1倍体构建策略,该策略允许我们很方便地从患者血清样本HBV DNA构建HBV1.1×重组体,从而大大方便了HBV表型分析相关研究。利用该策略,我们对一例ETV部分反应患者,及三例ADV治疗反应不佳患者血清HBV进行了表型分析,首次证实含有RT S246T变异的HBV对ETV仍然敏感,而含有RT N118H变异的HBV对ADV也仍然敏感,RT aa246及RT aa118位点在ETV及ADV耐药中的作用较小,提示当患者出现aa246及aa118突变时,使用ETV及ADV治疗仍然有效。