肥胖相关炎症为重要的代谢紊乱性疾病,机体脂质过量堆积引发多重应激,造成代谢失衡,炎症即为伴随代谢紊乱发生的重要病理现象。肥胖相关炎症具有慢性炎症性质,且在代谢紊乱向代谢综合征的发展进程中发挥决定性作用。肥胖相关炎症及其临床治疗学研究进展显示:一些用于治疗脂质代谢失衡、Ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪肝的药物,如他汀类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类(TZD)、二甲双胍等,在治疗糖、脂代谢综合征的同时,对代谢相关炎症也具有抑制或消减作用。其中,TZD类药物为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,以下简称PPARγ)的完全激动剂,它们在有效激活PPARγ的状况下,不仅可介导脂肪细胞分化、提高胰岛素敏感性,而且可抑制代谢炎症进程,因此TZD在抑制肥胖相关炎症方面表现出多重药效。但是,TZD类分子如罗格列酮、曲格列酮等已被大量研究证实具有严重的药物毒副作用,如强心脏毒性,致液体潴留、体重增加、骨质疏松,甚至肾、肝衰竭等。匹格列酮虽然副作用相对较小,却依然具有PPARγ全激动剂不可避免的弱点。因此,在靶向PPARγ的药物研发领域内,近期工作正致力于对全激动剂进行改构,将具PPARγ配体性质的化合物改变为半激动剂或无典型激动剂性质的活性结构分子。同时,在天然药源分子中筛选具调控PPARγ功能的调控子,以期达到在调控PPARγ功能的同时,降低毒副作用,同时控制代谢紊乱的目的。值得注意的是:PPARγ构像的可塑性特点为从天然产物中筛选PPARγ调控子提供了极大可能性,因此,从天然产物化合物库中筛选PPARγ调控子,不仅能提供大于标准组合化学所能提供的结构多样性,而且也有希望发现新型先导结构分子。基于以上思考,本实验室在天然产物库中,针对靶向调控PPARγ的天然产物库,进行了动物、细胞、分子水平上的多重筛选,Apigenin(芹菜素)为前期工作中所发现的对PPARγ有调控作用的黄酮化合物。Apigenin富含于多种可食用、药用植物中,具有多种生物学功效,特别是在抗氧化、抗炎、抗过敏反应中,表现出显著作用特点。不仅如此,众多研究表明Apigenin对肿瘤具有抑制作用,可用于皮肤恶性肿瘤的辅助治疗。Apigenin的生物学功能研究虽然已有多年历史,但对其确切分子机制的了解较少,特别是其在细胞内的分子靶向功能,至今鲜有报道。基于此,本论文研究工作从Apigenin遏制肥胖相关炎症的角度展开,得出Apigenin通过靶向结合并激活巨噬细胞中PPARγ进而对肥胖相关炎症起到显著遏制作用的重要结论。如前所述,PPARγ是调控细胞代谢的重要药物靶点,Apigenin所显示出的靶向结合PPARγ的特性提示我们:Apigenin在控制肥胖相关炎症及相关代谢紊乱方面具有潜在的药用价值。本论文研究内容由以下三部分组成:一、Apigenin显著抑制肥胖相关炎症进展1.小鼠肥胖模型的构建及炎症进展分析:建立高脂喂食(High-fat induced,以下简称HFD)诱发的小鼠肥胖模型。取12周小鼠肝脏、肌肉、附睾脂肪组织进行切片分析,H&E染色检测发现:HFD导致小鼠肝脏、肌肉呈现明显脂变性,脂肪组织中炎性细胞大幅度浸润。且随着肥胖程度的增加,血清中谷丙转苷酶AST、谷草转氨酶ALT、总胆固醇TC、甘油三酯TG、葡萄糖的水平以及全蛋白中羰基化蛋白质的含量,均显示有意义增加,说明机体处于代谢紊乱状态。ELISA检测血清促炎细胞因子(IL-6、TNF-α、CCL2等),显示表达水平显著上升,说明机体处在炎性状态中。考虑到巨噬细胞为代谢性炎症的中枢功能细胞,我们随后对巨噬细胞的功能进行了重点分析。流式检测表明肥胖程度与M1巨噬细胞增加呈正相关。M2型巨噬细胞在肥胖后期显著下降;RNA-Seq数字表达谱分析16周HFD小鼠腹腔巨噬细胞的转录组情况,发现小鼠腹腔巨噬细胞中,与胰岛素抵抗、T细胞激活相关基因表达显著提高,与炎症抑制相关的基因表达丰度降低,说明HFD在导致机体代谢紊乱的同时,诱发了炎症,且肥胖程度越高,炎症症状越严重。2.Apigenin显著抑制肥胖相关炎症:运用16周龄HFD小鼠模型,不同剂量(10 mg/kg,30 mg/kg,50 mg/kg)Apigenin处理21天,H&E检测分析结果显示Apigenin显著遏制肝脏、肌肉的脂变性,阻断脂肪组织炎性细胞的浸润,并减小脂肪细胞的大小,这些效应呈剂量依赖性。ELISA分析显示Apigenin极显著地降低了促炎细胞因子IL-6、TNF-α、CCL2等的释放,提高了抑炎因子IL-10、Adiponectin的释放;Apigenin显著降低谷丙转氨酶AST,谷草转氨酶ALT,总胆固醇TC,甘油三酯TG,葡萄糖的水平,这些数据说明Apigenin对HFD引起的代谢紊乱状态具有矫正作用;实验同时考察Apigenin对炎症进展的作用,取小鼠腹腔巨噬细胞与附睾脂脂肪相关巨噬细胞,进行流式细胞检测及RT-QPCR分析,结果显示Apigenin提高了巨噬细胞中M2型分子的高表达,降低了 M1型分子的表达,并呈现剂量依赖性质。说明Apigenin处理可改变巨噬细胞中M1/M2比例,Apigenin所导致的巨噬细胞M1/M2比例降低,有利于炎症向消减方向发展。3.Apigenin作用特性分析:在HFD模型中,我们将Apigenin作用特点与经典的PPARγ全激动剂罗格列酮进行比较,发现Apigenin 50 mg/kg剂量组显示出与罗格列酮相同的改善肝脏、肌肉脂变性,抑制脂肪组织炎性细胞浸润、炎性细胞因子释放的功效。值得强调的是:Apigenin不具有罗格列酮的典型毒副作用,不引起小鼠体重增加与骨质疏松症。说明Apigenin可能是PPARγ的调控子,并具备不同于PPARγ的完全激动剂罗格列酮的作用特点。4.细胞实验分析Apigenin对巨噬细胞的功能、表型影响:在证实了 Apigenin可调控HFD小鼠巨噬细胞功能并抑制机体炎症进展的基础之上,我们建立了体外细胞模型,运用IL-4和LPS分别刺激巨噬细胞使之分别激活为经典M2、M1型巨噬细胞模型,在此模型中,首先采用MTT和CCK-8分析Apigenin对巨噬细胞生存率的影响,结果显示其可以剂量和时间依赖性地抑制巨噬细胞的生存率,流式分析结果说明在低于10 浓度时,Apigenin不引起巨噬细胞死亡;对Apigenin影响巨噬细胞的功能进行研究,发现Apigenin可以抑制巨噬细胞的吞噬能力、抗原递呈能力以及ROS和NO的释放。在M1、M2细胞模型中,Apigenin对巨噬细胞表型极化分析发现:Apigenin可以极显著地抑制M1型表型分子如NO释放,IL-6、IL-12、TNF-α等的表达,增强M2型分子精氨酸酶活性、抑炎因子IL-10等的表达,与体内试验结果一致。说明Apigenin的确具有调控巨噬细胞功能和表型的作用。二、Apigenin 靶向结合PPARγ的分析1.Apigenin与PPARγ直接结合分析:在ANA-1巨噬细胞中,运用RT-QPCR分析,发现Apigenin不影响PPARγ的mRNA水平,但荧光素酶报告基因分析显示,Apigenin可以剂量依赖性地激活PPARγ,并激活PPARγ下游靶基因CD36,NOS2。在证实了 Apigenin对PPARγ活性具有调控功能的情况下,我们进一步对Apigenin与PPARγ的相互作用进行了研究。实验首先构建了 pCzn1-PPARγ原核表达载体,在Arctic Expression TM原核宿主菌中表达,最终分离纯化获取了鼠源的PPARγ-his融合蛋白。将PPARγ-his融合蛋白与 Apigenin 进行等温滴定量热试验(Isothermal quantitative thermal test,ITC),以Origin软件中独立结合试验模型进行非线性最小方差拟合,计算出Apigenin与PPARγ作用的本征结合常数K、PPARγ的Apigenin结合位点数N分别为:4.49E4±6.04E4M.1,13.8±7.25 Sites,本征摩尔结合Gibbs 自由能和本征摩尔结合熵分别为△H=-4.324E6±9.487E4 cal/mol,AS=-1.43E3 cal/mol/deg,说明 Apigenin 可以与 PPARγ直接结合。2.PPARγ截短体实验:基于二、1的研究结果,我们进一步寻找PPARγ与Apigenin结合的关键氨基酸残基。首先构建了 PPARγ的N端截短体,继后运用荧光素酶报告基因方法对Apigenin活化PPARγ的效应进行研究,结果发现,△DBD,△Hinge和WT组对Apigenin的响应是一致的,而△LBD对Apigenin无应答反应,说明PPARγ181-475aa区域对Apigenin结合PPARγ是必需的。3.点突变试验:为进一步鉴定PPARγ181-475aa区域中与Apigenin结合的氨基酸或序列,我们首先运用Autodock4.2软件对Apigenin与人源的PPARγ进行了分子对接虚拟预测,结果表明Apigenin通过氢键可以与PPARγ序列中的四个氨基酸263Lys,265 Lys,340Leu,342Ser结合;根据这一预测结果,我们运用Direct-mutant方法进行了点突变试验,结果证实若将4个氨基酸分别突变为Arg,Phe,Thr后,Apigenin失去激活PPARγ的功能,说明这四个氨基酸对Apigenin激活PPARγ是必须的。在此基础上,我们进一步又进行了两两组合突变,三三组合突变实验以及全突变,发现这四个氨基酸形成的口袋及其酸碱性质符合Apigenin结合并激活PPARγ的需要。二、Apigenin遏制肥胖相关炎症的机制1.Apigenin对M1/M2巨噬细胞比例的调控依赖于PPARγ:为验证Apigenin通过活化PPARγ而使巨噬细胞中M1与M2型细胞比例发生改变,实验采用慢病毒转染技术构建了过表达PPARγ和ShRNA敲减的PPARγ巨噬细胞株。继后,通过流式细胞分析、RT-QPCR以及酶活性分析等方法检测,发现细胞过表达PPARγ的情况下Apigenin降低M1/M2巨噬细胞的功效增强;ShRNA敲减PPARγ、PPARγ拮抗剂GW9662处理的情况下,Apigenin降低M1/M2巨噬细胞的功效被减弱了。证实ApigeninM1/M2巨噬细胞比例的的调控依赖于PPARγ。2.Apigenin抑制NF-κB通路:多项前期研究已证实通过激活PPARγ,可对NF-κB通路进行抑制。本研究中,在对HFD小鼠腹腔巨噬细胞进行RNA-Seq表达谱分析时,也得到相似结果,HFD小鼠腹腔巨噬细胞中NF-κB/P65的mRNA表达水平显著增加,Western blotting检测显示P65的蛋白水平明显上调。Apigenin腹腔注射HFD小鼠后,活化腹腔巨噬细胞中PPARγ的同时,P65表达量显著下调。NF-κB的抑制结合蛋白IκBα磷酸化水平下降,进而免疫荧光分析结果亦显示Apigenin在激活PPARγ的同时,抑制NF-κB/P65入核;荧光素酶报告基因检测分析显示Apigenin显著抑制NF-κB/P65的活性。结合已知的PPARγ抑制NF-κB通路的特性,我们认为在脂肪相关炎症进展中,Apigenin通过激活PPARγ,改变了 PPARγ与NF-κB/P65的交互对话方式,从而抑制了 NF-κB/P65通路,降低了炎症反应。综上所述,本论文研究鉴定了 Apigenin具有靶向结合PPARγ并激活其转录活性的功能;与此同时,发现Apigenin通过结合PPARγ而调控M1/M2巨噬细胞比例、进而抑制肥胖相关炎症的效应;阐明了 Apigenin可通过激活PPARγ而抑制NF-κb通路、改变巨噬细胞炎性表型与炎性状态的作用特点。值得强调的是:通过我们的研究工作,证实Apigenin是一种安全、有效的具激动剂性质的PPARγ调控子,这可为基于Apigenin进一步研发相关药物提供重要科学依据。