枣成熟胚离体培养及农杆菌介导叶片与胚遗传转化研究

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枣是鼠李科(Rhamnaceae)枣属(ZiziphusMill.)植物,其产量在三大干果中占据首位。因枣花期不一致,且花小,授粉困难,在自然条件下坐果率低,且胚败育严重,同时还存在严重的病虫害。传统育种方法周期长、效率低,不易获得优良抗性新品种。本实验以酸枣成熟胚为材料,建立了枣胚离体再生体系,为枣胚的遗传转化研究奠定基础;另外,以灰枣叶片和蜂蜜罐成熟胚为材料,进行了农杆菌介导枣树抗虫基因遗传转化的研究。主要结果如下:1枣成熟胚离体再生体系的建立试验结果表明:以常温保存1年的成熟胚的萌芽率较高,适宜启动培养基为不添加任何植物激素的MS;增殖培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L;培养基中加入PVP1.5mg/L时对褐化有很好的抑制效果。2农杆菌介导枣树抗虫基因遗传转化研究试验以枣叶片和胚为转化受体研究发现,用农杆菌菌株EHA105侵染外植体,共培养结束后,后期脱菌困难,只有菌液浓度在OD600=0.2,侵染时间为12min,共培养3d后,洗菌后能有效抑菌,获得不定芽;枣树对除草剂basta非常敏感,浓度在2mg/L时的褐化死亡率高达96.5%。初步认为枣树的遗传转化不宜用除草剂basta作为筛选剂。不同种或同一种植物的不同品种对除草剂basta的敏感性差别较大,其应用在草本上较为常见。而在木本植物遗传转化时,应用最多的筛选剂是卡那霉素,且本课题组通过研究,已得到卡那霉素在灰枣上的筛选浓度为40mg/L。在后续进行灰枣抗虫基因Bt遗传转化研究前,可考虑对原有基因载体进行改造,将原有的抗除草剂筛选的bar基因替换成抗卡那霉素筛选的新霉素磷胺酸转移酶基因NPTⅡ。
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