【摘 要】
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目的:1、研究TLR4敲除对糖尿病大鼠骨代谢、骨密度和体成分及m6A修饰酶影响。2、探究TLR4是否通过调节FTO介导高糖高脂影响破骨细胞分化。方法:1、选用雌性SPF级SD大鼠,高糖高脂饮食加上STZ注射构建糖尿病大鼠模型,以及构建TLR4敲除SD大鼠。分为NC组、DM组、TLR4KONC组、TLR4KODM组。糖尿病鼠造模成功后,对照组与实验组均观察6周。观察TLR4基因敲除对糖尿病SD大鼠血
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目的:1、研究TLR4敲除对糖尿病大鼠骨代谢、骨密度和体成分及m6A修饰酶影响。2、探究TLR4是否通过调节FTO介导高糖高脂影响破骨细胞分化。方法:1、选用雌性SPF级SD大鼠,高糖高脂饮食加上STZ注射构建糖尿病大鼠模型,以及构建TLR4敲除SD大鼠。分为NC组、DM组、TLR4KONC组、TLR4KODM组。糖尿病鼠造模成功后,对照组与实验组均观察6周。观察TLR4基因敲除对糖尿病SD大鼠血脂、骨代谢指标、骨密度、体成分以及对m6A甲基化修饰酶影响。2、构建高糖高脂干预破骨细胞模型。体外细胞实验采用破骨前体细胞RAW264.7细胞系。观察抑制TLR4活性对高糖高脂干预破骨细胞分化影响及FTO表达水平。Western blot检测TLR4抑制剂CLI-095效果。通过TRAP染色检测破骨细胞数目;鬼笔环肽荧光染色检测破骨细胞骨架F-actin环荧光强度;实时定量PCR、Western blot检测破骨细胞分化相关基因（MMP-9、NFATc1、TRAP）和FTO的蛋白质表达。3、调控FTO表达对高糖高脂干预破骨细胞分化的作用以及与TLR4的关系。构建敲低或过表达FTO RAW264.7细胞系,再予高糖高脂+破骨细胞诱导液干预细胞5天。同上述方法检测破骨细胞的分化情况;通过实时定量PCR、Western blot检测破骨细胞分化基因m RNA、蛋白质及TLR4表达情况。结果:1.TLR4敲除调控m6A修饰酶改善糖尿病大鼠体成分紊乱及骨密度我们发现TLR4敲除未对SD大鼠体重、体长产生明显影响,通过检测各组大鼠血糖、胰岛素水平证实我们成功构建糖尿病SD大鼠模型。也发现了TLR4敲除未对SD大鼠血糖及胰岛素产生明显影响。检测各组大鼠血脂水平,糖尿病会导致大鼠血脂升高。检测各组大鼠骨代谢指标,发现糖尿病会导致大鼠骨形成指标下降,骨吸收指标增强,引起骨代谢紊乱。通过双能X线吸收测量法检测发现NC组相比,DM组大鼠骨密度下降。与DM组相比,TLR4KODM组BMD明显增加。体成分结果提示与NC组相比,DM组大鼠肌肉、骨矿盐含量下降,而脂肪量升高。与DM组相比,TLR4KODM组大鼠肌肉、骨矿盐含量升高,脂肪量下降。腰椎3（L3）Micro-CT结果发现与DM组相比,TLR4KODM组L3体积骨密度增加。我们通过实时定量PCR检测m6A修饰酶,我们发现与NC组相比,DM组FTO水平下降,而TLR4基因敲除可上调糖尿病大鼠FTO水平,而其余m6A修饰酶没有相似现象。结果提示敲除TLR4可能调控FTO改善糖尿病大鼠体成分紊乱及骨密度。2.抑制TLR4活性可减弱高糖高脂诱导的破骨细胞分化并上调FTO表达我们发现与NC组比,HG+PA组破骨细胞数目明显增多、破骨细胞骨架F-actin环荧光强度更强,与HG+PA组比较,HG+PA+CLI-095组的破骨细胞数目减少、破骨细胞骨架F-actin环荧光强度降低。实时定量PCR、Western blot结果显示,高糖高脂干预促进破骨细胞分化基因（MMP-9、NFATc1、TRAP）m RNA及蛋白表达;与HG+PA组比较,HG+PA+CLI-095组破骨细胞分化基因（MMP-9、NFATc1、TRAP）m RNA、蛋白表达量均下降;以上结果表明抑制TLR4活性可削弱高糖高脂诱导的破骨分化。Western blot发现高糖高脂干预,可抑制FTO蛋白表达;而抑制TLR4活性可上调高糖高脂干预的RAW264.7细胞的FTO蛋白表达;提示抑制TLR4活性可减弱高糖高脂诱导的破骨细胞分化并上调FTO表达。3.调控FTO表达可影响高糖高脂诱导的破骨细胞分化及TLR4表达我们发现与HG+PA组比较,FTOKD+HG+PA组破骨细胞数目显著增加、破骨细胞骨架F-actin环荧光强度增强,破骨细胞分化基因（MMP-9、NFATc1、TRAP）m RNA、蛋白表达增加;而FTOOE+HG+PA组破骨细胞数目显著减少、破骨细胞骨架F-actin环荧光强度降低,破骨细胞分化基因（MMP-9、NFATc1、TRAP）m RNA、蛋白表达减少。与HG+PA组比较,FTOKD+HG+PA组和FTOOE+HG+PA组TLR4蛋白表达变化无统计学差异。提示FTO表达水平影响高糖高脂干预的破骨细胞分化。结论:高糖高脂可通过激活TLR4并抑制FTO促进RAW264.7细胞破骨分化。
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