中国苹果炭疽病病原菌的遗传多样性

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苹果炭疽病是苹果上一种主要病害,引起大量落果或落叶,贮藏期果实腐烂,给果农及消费者造成巨大的经济损失。本研究对我国辽宁、山东、河南和陕西等苹果主产区苹果炭疽病的病原菌进行了系统鉴定和分类研究,分析了不同地区苹果炭疽病病原菌的群体遗传多样性及构成,对果园周边相关寄主的炭疽病病原菌进行系统鉴定并分析其在苹果炭疽病发生中的作用,取得了以下主要结果。1.从2010~2012年自中国辽宁、山东、河南和陕西等苹果主产区采集了苹果炭疽病标样285份,分离纯菌株98株,对其形态学、分子系统学和致病性进行分析。对分离的苹果炭疽病病原菌进行内转录间隔区序列(ITS)、肌动蛋白(ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、几丁质酶(CHS-1)和β-微管蛋白2(TUB2)单基因及多基因联合的系统发育分析,综合形态学鉴定结果,确定我国苹果炭疽病病原菌可分为7个分类单元,包括已知种6个,新种1个,其中引起果实苦腐病的病原有6个种,分别为:异国刺盘孢C. alienum、果生刺盘孢C. fructicola、胶孢刺盘孢C. gloeosporioides、睡莲刺盘孢C. nymphaeae、暹罗刺盘孢C. siamense和新种—东方刺盘孢C. orientalis,从菌株分离率来说,占总菌株数62.2%的暹罗刺盘孢C. siamense是优势种;苹果炭疽叶枯病的病原分两个种:包括隐秘刺盘孢C. aenigma和果生刺盘孢C. fructicola,其中果生刺盘孢C.fructicola是优势种。致病性测定显示7个种的菌株有伤接种果实均能发病,分自苹果苦腐病症状的6个种的菌株无伤接种也均可致病,并在果面产生典型的苦腐病症状;不同种的致病力存在差异,异国刺盘孢C. alienum的菌株F11PGZH02致病力最强(发病率100%);分自苹果叶枯病症状的两个种的菌株无伤接种富士苹果都不发病,但接种秦冠苹果都发病,显示不同品种的苹果对炭疽叶枯病菌的抗性存在显著差异。2.为了探讨苹果炭疽病病原菌的群体遗传多样性和群体遗传结构,本研究采用正交试验对ISSR-PCR反应体系进行优化,并利用优化的体系对35条ISSR通用引物进行了筛选,利用筛选的10条多态性引物和优化的ISSR-PCR反应体系对我国不同地理来源的67株刺盘孢菌株进行ISSR聚类分析,10条引物共扩增出65个位点的多态性条带,多态率100%。物种水平的聚类分析结果显示,在遗传相似系数0.76水平时,代表性刺盘孢菌株可区分为7个亚群,分别对应于多基因分析中的隐秘刺盘孢C. aenigma、异国刺盘孢C.alienum、果生刺盘孢C. fructicola、胶孢刺盘孢C. gloeosporioides、东方刺盘孢C.orientalis、睡莲刺盘孢C. nymphaeae和暹罗刺盘孢C. siamense。说明ISSR分子标记对刺盘孢属具有良好的种间及种内区分性,非常适于对炭疽病病原菌遗传多样性的研究。通过对不同地理来源的67株苹果炭疽病病原菌菌株的群体遗传多样性的分析发现,Nei’s基因多样性指数(H)均大于0.2水平,Shannon信息指数(I)也均大于0.3水平,证明我国苹果炭疽病病原菌具有丰富的遗传多样性。通过对三个地理种群的遗传结构分析发现,遗传分化系数(Gst)显示渤海湾区最高,说明渤海湾区的遗传多样性最为丰富,内部的遗传分化较大,但毎代迁移数Nm<1,说明种群内的基因交流受到抑制;而后两个地区黄河故道区和西北高原区的Gst值都较小但种群的毎代迁移数Nm较大,说明这两个种群遗传分化较小,种群遗传变异主要来自于群落内,种群内都存在丰富的基因交流。综合三个地理种群毎代迁移数Nm=0.72,说明三个地区之间存在一定的菌源交流。3.自2011~2012年从陕西不同地区采集的蔷薇科、豆科、茄科等植物上具有炭疽病病症的标样85份,共分得刺盘孢菌株41株,选取21株菌株构建ITS的系统发育树,结果显示21个果园周边寄主的炭疽病病原菌可初步分为8个类群,选取其中可能与苹果炭疽病病原菌分类相同的5株代表性菌株进行多基因系统发育树的构建,结果表明从梨、辣椒和猕猴桃上分到的部分刺盘孢菌株与分自苹果的刺盘孢菌株分类相同,说明胶孢刺盘孢C. gloeosporioide和果生刺盘孢C. fructicala的菌株除可侵染苹果,还可侵染猕猴桃、辣椒和梨等寄主。按照同样方法对21株果园周边寄主的炭疽病病原菌进行ISSR-PCR扩增,聚类分析显示,在相似系数0.68处,29株菌株可分为8个类群,与ITS和多基因系统发育分析结果基本一致。对其中6个分类单元的10株菌株在苹果上进行致病性测定,结果显示所有菌株有伤接种均可发病;而归属为尖孢刺盘孢C. acutatum、猪毛菜刺盘孢C. salsolae和西蒙德刺盘孢C. simmondsii的菌株无伤接种不能发病,证明它们对苹果没有致病性;而分别归属于果生刺盘孢C. fructicola、胶孢刺盘孢C.gloeosporioides和松针刺盘孢C. fiorinae的菌株无伤接种都可以发病,并显示典型苹果炭疽病症状,说明它们对苹果均具有致病性,进一步证明果园周边梨、辣椒和猕猴桃等寄主可以作为苹果炭疽病潜在的初侵染源。本研究首次系统地对苹果炭疽病病原菌进行分离和鉴定,通过国际上最新的多基因系统分类学与形态学相结合的多相分类技术明确我国苹果炭疽病病原菌构成。本研究发现ISSR分子标记作为核苷酸序列分析辅助手段,不但可以区分刺盘孢属种间遗传分化,还可以区分种内遗传分化,适宜于对炭疽病病原菌的群体遗传多样性、群体遗传结构和菌源传播关系等方面的研究。利用多基因分析、ISSR分子标记和致病性测定等多方面综合分析证明果园周边寄主可以作为苹果炭疽病潜在初侵染来源,为炭疽病的有效防治提供了理论基础。
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