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第一部分探究DMF对高草酸尿肾结石大鼠模型肾脏中钙盐沉积和成骨样转化的影响【目的】探究富马酸二甲酯对一水乙醛酸诱导的高草酸尿肾结石大鼠肾脏中钙盐沉积以及成骨相关蛋白表达的影响。【方法】将40只雄性SD大鼠随机分为对照组(control)、一水乙醛酸造模组(GAM组)、治疗组(GAM+DMF组)和溶剂对照组(GAM+MC组),每组10只。其中对照组大鼠自由进食水;一水乙醛酸造模组通过腹腔注射一水乙醛酸诱导建立高草酸尿肾结石模型;治疗组在造模基础上,给予DMF灌胃;溶剂对照组,在造模基础上,给予MC灌胃。每3天测量大鼠体重,连续处理10天后收集各组大鼠24小时尿液、血清标本和肾脏组织,测定尿钙、尿草酸含量。测定血清肌酐值;免疫组化及western blot法检测大鼠肾脏组织中成骨相关蛋白(OPN、BMP2)的表达水平;采用HE染色对大鼠肾脏组织切片进行组织学分析;硝酸银染色检测钙盐沉积;偏振光光学显微观察草酸钙晶体分布情况。【结果】对照组大鼠的体重明显高于其他三组;各组大鼠24小时尿量及尿钙水平未见明显差异;GAM组、GAM+DMF组和GAM+MC组尿草酸水平明显高于对照组;GAM组和GAM+MC组血清肌酐值明显高于对照组,DMF处理显著降低了血清肌酐值;HE染色显示GAM组和GAM+MC组肾组织有明显的组织学损伤,DMF处理显著改善了这些变化;GAM组和GAM+MC组肾脏皮质与髓质交界处有明显钙盐沉积,DMF明显减少了肾脏组织中钙盐沉积;免疫组化及western blot提示GAM组和GAM+MC组肾组织内成骨相关蛋白(OPN和BMP2)的表达水平较对照组均明显升高,而DMF显著逆转了该效应。【结论】高草酸尿可诱导肾脏组织损伤、钙盐沉积、成骨样转化,而DMF可减轻上述效应,有望成为预防高草酸尿介导的肾结石形成的药物。第二部分DMF减轻高草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤的机制研究【目的】探究DMF对高草酸诱导的肾小管上皮细胞氧化应激损伤、炎症反应、凋亡的影响及其机制。【方法】用草酸钾处理NRK-52E细胞,加入DMF,CCK-8检测NRK-52E细胞活性;DHE荧光染色法测定高草酸尿肾结石大鼠模型及DMF治疗模型肾脏组织活性氧水平;采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞膜损伤毒性;丙二醛(MDA)试剂盒检测细胞脂质过氧化损伤;western blot及免疫组化法检测炎性相关因子(IL-6和MCP-1)、凋亡相关蛋白(Caspase-3)表达情况;TUNEL法检测肾组织凋亡水平。【结果】我们的结果显示DMF可以减轻草酸对NRK-52E细胞活力的抑制;并降低了草酸诱导的MDA生成及LDH释放;DMF可显著减轻高草酸诱导的肾组织内ROS水平;DMF可减轻高草酸诱导的肾组织细胞炎性因子释放水平;DMF可减轻高草酸诱导的肾组织细胞凋亡。【结论】DMF可减轻草酸诱导的肾小管上皮细胞氧化应激、炎症反应及凋亡。第三部分DMF通过激活Nrf2/Keap1通路减轻高草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤【目的】探究Nrf2/Keap1通路在高草酸诱导的肾小管上皮细胞氧化应激、炎症反应中的作用及机制。【方法】采用草酸钾处理NRK-52E细胞,采用小干扰RNA(siRNA)试剂盒进行基因敲除实验;q PCR检测Nrf2、Keap1 m RNA表达量;用ATP试剂盒检测细胞ATP水平;用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;免疫组化及western blot检测Nrf2、Keap1、NADPH氧化酶亚基(p22、Nox2、Nox4)、炎性相关蛋白(MCP-1、IL-6)、成骨相关蛋白(OPN、BMP2)及凋亡相关蛋白Caspase-3表达情况,免疫荧光分析Nrf2在细胞内的分布;流式细胞技术分析细胞凋亡情况,流式细胞术分析细胞内、线粒体内活性氧水平。【结果】高草酸尿肾结石大鼠肾脏组织中Nrf2表达下调、Keap1表达上调,应用DMF治疗可逆转这一效应;免疫荧光实验显示,在草酸钾诱导下,NRK-52E细胞核内Nrf2抗体的荧光强度降低,DMF可促进Nrf2进入细胞核。Western blot检测显示DMF抑制了草酸钾诱导的NRK-52E细胞浆中Keap1的表达,上调了细胞核Nrf2的表达;Western blot检测显示DMF可降低草酸钾诱导的NRK-52E细胞的炎症(MCP-1、IL-6)、凋亡(Caspase-3)和成骨相关蛋白(OPN、BMP2)表达量;流式细胞术检测显示DMF能降低暴露于高草酸钾环境NRK-52E细胞凋亡水平;DMF改善草酸钾诱导的NRK-52E细胞中线粒体膜电位的破坏;DMF上调了草酸钾抑制的NRK-52E细胞ATP水平;Western blot检测显示与对照组相比,DMF显著降低了草酸钾诱导的NRK-52E细胞中Nox4和p22的蛋白表达上调,在此过程中Nox2表达量保持不变;流式细胞技术显示与草酸诱导的细胞相比,DMF预处理显著降低细胞内和线粒体活性氧水平;Nrf2si RNA转染部分阻断了这些效应,Keap1 si RNA转染增强了这些效应。【结论】这些结果表明,DMF通过上调肾小管细胞核内Nrf2水平,抑制高草酸诱导的NADPH氧化酶亚基Nox4和p22升高,从而改善细胞内和线粒体氧化应激,纠正线粒体代谢异常,抑制细胞炎症反应、成骨分化及凋亡。