甜味蛋白是一类天然非糖类甜味物质,具有高甜度、低热卡、无毒安全、多功能等优点。Brazzein甜味蛋白是1994年从非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon的果实中分离提纯得到,其甜度是等质量蔗糖的2000倍。到目前发现的7种甜蛋白中,Brazzein分子量最小,仅为6.5kD,它具有良好的水溶性,其结构相对简单并具有良好的热稳定性和pH稳定性,这些特性可有效解决目前甜蛋白应用过程中稳定性差,提取、加工困难等的问题,应用前景十分广阔。但天然产生的Brazzein资源有限,提取、分离成本昂贵;目前利用生物工程获得甜味蛋白的的研究中,原核系统表达获得的甜味蛋白易形成包涵体,表达的目的蛋白生物活性低或无生物活性;而用毕赤酵母表达系统获得Brazzein的报道较少。本研究采用pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建高效、分泌型的Brazzein毕赤酵母表达系统。根据文献报道Brazzein的氨基酸序列,按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因。敲除N端第一个氨基酸,同时将Brazzein蛋白中的第29位的天冬氨酸（Asp）变为天冬氨酰（Asn）,41位的谷氨酸Glu（E）变为赖氨酸Lys（K）,并根据表达载体pGAPZαA多克隆位点特点以及Brazzein基因酶切特性,设计4对引物,在上、下游引物分别引入Xba I与Xho I酶切识别位点。采用SOE-PCR法人工合成甜蛋白Brazzein基因,构建克隆载体pUC57- Bra,通过PCR、酶切和测序鉴定后,将正确的Brazzein基因克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,经鉴定,结果表明成功构建了pGAPZαA-Bra酵母表达载体。将重组质粒经限制性内切酶AvrⅡ线性化,用电转化的方法导入Pichia. pastoris SMD1168中,整合到毕赤酵母染色体的高效启动子3,-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的下游。用高浓度的Zeocin抗生素筛选高拷贝转化子,用Brazzein基因特异引物进行PCR鉴定,结果证明已获得整合型阳性重组菌株,命名为SMD1168/pGAPZαA-Bra。将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,筛选菌株后进行大规模培养,通过收集不同时间段的表达产物,进行SDS-PAGE分析表明,在诱导72h后目的蛋白表达量最大,达0.12g/L,表达蛋白的分子量约为6.5KD左右。对纯化后的蛋白进行了生物活性测定,经品尝鉴定具有一定的甜味,表达的Brazzein蛋白生物学活性良好。综上所述,本研究成功构建了甜蛋白的真核表达载体pGAPZαA-Bra,并在SMD1168酵母受体菌中成功表达,为甜蛋白的进一步研究与应用打下了坚实基础。