结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤,虽然外科手术、放疗、化疗等治疗技术已有较大提高,但由于大部分结直肠癌患者在确诊时即处于进展期,丧失了接受标准治疗的机会,预后较差且面临无药可用的困境。近年来出现的程序性死亡蛋白-1(programmed cell death-1,PD-1)免疫靶向治疗在高水平微卫星不稳定晚期结直肠癌患者中取得鼓舞人心的结果。然而,临床绝大多数表现为微卫星稳定(microsatellite instability,MSS)结直肠癌患者,由于对PD-1抗体治疗缺乏敏感性,丧失了免疫检查点抑制剂治疗的机会。干扰素γ(interferon gamma,IFNγ)是肿瘤微环境中活化的免疫细胞合成分泌的一种细胞因子。在PD-1抗体治疗优势人群的临床实践中观察到:PD-1抑制剂的抗肿瘤效应与治疗前肿瘤微环境程序性死亡配体-1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)通路激活水平密切相关;IFNγ可以诱导肿瘤微环境细胞PD-L1的表达,促进PD-1/PD-L1信号通路的活化。因此,本研究通过体外实验(第一部分及第二部分)和体内实验(第三部分)探讨IFNγ作为微卫星稳定结直肠癌PD-1抗体免疫治疗增敏剂的相关机制。第一部分IFNγ作用下体外培养MSI和MSS结直肠癌细胞PD-L1表达的差异性分析[目的]观察IFNγ作用下体外培养人源性MSI细胞系和MSS细胞系PD-L1的表达差异性。[方法]利用流式细胞术和蛋白质免疫印迹检测IFNγ作用下体外培养人源性 MSI 细胞系 HCT116、LOVO、HCT15 和 MSS 细胞系 SW480、SW620、SW1116的PD-L1表达。[结果]1.PD-L1表达的流式细胞术结果:结直肠癌MSI细胞系(HCT116、LOVO、HCT15)和MSS细胞系(SW480、SW620、SW1116)在正常培养条件下,细胞表面PD-L1分子的表达极低且无统计学差异;100IU/mlIFNγ处理12h后,经流式细胞术分析显示,所有细胞表面PD-L1分子的表达均明显上调,且MSI细胞系(HCT116、LOVO、HCT15)细胞表面PD-L1分子的表达显著高MSS细胞系(SW480、SW620、SW1116)。2.PD-L1表达的蛋白质免疫印迹结果:MSI细胞系在IFNγ诱导下,PD-L1蛋白表达均高于MSS细胞系,表达变化与流式细胞术结果一致。[结论]外源性IFNγ诱导结直肠癌细胞表达PD-L1分子;MSI结直肠癌细胞对IFNγ的反应性高于MSS结直肠癌细胞。第二部分IFNγ诱导MSI和MSS细胞PD-L1差异性表达的信号机制研究[目的]观察IFNγ诱导结直肠癌细胞PD-L1表达的信号通路,明确FNγ诱导MSI和MSS细胞PD-L1表达信号机制关键分子的差异性。[方法]利用逆转录聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹检测不同浓度IFNγ作用下体外培养HCT116和SW480细胞PD-L1的表达;分别使用抑制剂分子PD98059(ERK1/2 抑制剂)、wortmannin(AKT 抑制剂)和 fludara(STAT1 抑制剂)预处理体外培养结直肠癌MSI和MSS细胞,观察IFNγ作用下PD-L1表达上调的相关信号机制;采用RT2 Profiler PCR Array技术,寻找HCT116细胞和SW480细胞PD-L1表达信号通路关键分子mRNA分布差异性;利用蛋白质免疫印迹进一步观察STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3在MSI细胞和MSS细胞中的表达情况。[结果]1.不同浓度IFNγ对MSI细胞HCT116和MSS细胞SW480 PD-L1表达的影响。1.1 PD-L1 mRNA相对表达量:不同浓度IFNγ处理SW480和HCT116后,与空白对照组比较,PD-L1 mRNA相对表达量均升高,其中100IU/ml的IFNγ诱导的PD-L1相对表达量在两种微卫星状态细胞中均表现为最高;100 IU/ml、500IU/ml、1000 IU/ml 和 5000 IU/ml IFNγ 诱导下,HCT116 细胞 PD-L1mRNA 相对表达量均高于SW480细胞,差异均有统计学意义。1.2PD-L1表达的蛋白质免疫印迹结果:HCT116细胞和SW480细胞均在100 IU/ml IFNγ处理下PD-L1蛋白表达增强最为明显,与转录水平一致;HCT116细胞在100 IU/ml和500 IU/ml IFNγ诱导下,PD-L1蛋白表达均显著高于SW480细胞,表达趋势与转录水平一致。2.IFNγ诱导结直肠癌细胞PD-L1分子表达涉及的信号途径:采用化学阻滞剂封闭STAT1信号后,低剂量IFNγ诱导的HCT116、HCT15细胞和SW480、SW620细胞表面PD-L1表达上调的分子效应被部分阻断,而封闭AKT信号和ERK1/2信号不影响IFNγ诱导的结直肠癌细胞表面PD-L1表达上调的分子效应。3.JAK-STAT信号通路关键分子在HCT116细胞和SW480细胞间的表达差异性分析3.1正常培养条件下HCT116和SW480细胞JAK-STAT信号通路关键分子mRNA相对表达的差异性:与SW480比较,HCT116细胞有19个JAK-STAT信号分子mRNA的相对表达增加超过2倍;HCT116细胞有2个JAK-STAT信号分子mRNA的相对表达降低超过2倍。IFNγ受体在两种结直肠癌细胞中未见明显差异。3.2 IFNγ作用下HCT116和SW480细胞的JAK-STAT信号通路关键分子mRNA相对表达的差异性:经100IU/ml IFNγ处理HCT116和SW480细胞12h后,在MSS细胞SW480的JAK-STAT信号通路84个关键分子中,观察到了 15个分子mRNA相对表达变化超过2倍,其中,降低的有3个,增加的有12个。在MSI细胞HCT116中,观察到了 24个分子mRNA相对表达变化超过2倍,其中,降低的有14个,增加的有10个;100IU/mlIFNγ处理SW480和HCT116细胞12h后,IFNγ受体表达均未见明显改变;CXCL9在两种细胞中变化均最为显著,分别是100.19倍和68.53倍;低浓度IFNγ作用细胞后,仅在SW480细胞中观察到了 JAK2(2.11倍)和STAT2/3(2.06倍、2.04倍)分子mRNA相对增加的表达变化,而在HCT116细胞上,则观察到了 JAK3(-2.87倍)和STAT5A/5B(-2.14倍、-2.06倍)分子mRNA相对降低的表达变化。4.STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3 在 MSI 细胞和 MSS 细胞中的表达分析:正常培养条件下,结直肠癌细胞STAT1和STAT3均有不同程度的表达。100IU/ml IFNγ作用下,MSI和MSS细胞都表现出STAT1的显著磷酸化,12h后,两类结直肠癌细胞STAT1表达均明显增加;IFNγ作用下,STAT3仅在MSS细胞(SW480和SW620)表现出显著地磷酸化和蛋白水平增加,而MSI细胞STAT3磷酸化水平较低,且12h后蛋白表达未观察到明显变化。[结论]MSI结直肠癌细胞对IFNγ的反应性高于MSS细胞;外源性IFNy诱导结直肠癌细胞表达PD-L1分子主要是通过JAK-STAT1信号通路的活化来实现的;STAT3的表达上调可能影响了 MSS结直肠癌细胞对IFNγ的反应性。第三部分IFN-y/PD-L1促进微卫星稳定结直肠癌PD-1抗体治疗效果的研究[目的]探讨IFNγ及下游靶分子PD-L1影响微卫星稳定结直肠癌PD-1抗体治疗效果及相关机制。[方法]体外构建PD-L1过表达载体,慢病毒包装后转染小鼠源性微卫星稳定结直肠癌CT26细胞;在建立CT26细胞、PD-L1过表达CT26细胞Balb/c鼠皮下成瘤结直肠癌动物模型的基础上,使用外源性IFNγ诱导荷瘤小鼠瘤体组织PD-L1和CXCL9的表达;利用PD-L1和CD8、PD-L1和E-cadherin免疫荧光共染方法初步了解外源性IFNγ作用下荷瘤小鼠瘤体组织中PD-L1表达的细胞分布;使用PD-1抗体瘤旁注射治疗微卫星稳定结直肠癌Balb/c小鼠,分别观察外源性IFNγ干预和CT26细胞PD-L1过表达对PD-1抗体治疗引起的Balb/c荷瘤小鼠瘤体重量和体积变化的影响;使用CD8、E-cadherin免疫荧光染色方法分析Balb/c荷瘤小鼠瘤体组织中肿瘤细胞和CD8+淋巴细胞检出率;利用TUNEL染色初步了解IFNγ及下游靶分子PD-L1在PD-1抑制剂治疗Balb/c荷瘤小鼠中涉及组织细胞凋亡的相关机制;最后采用RT-PCR和荧光染色技术,观察CT26细胞PD-L1过表达对PD-1抗体治疗引起的肿瘤免疫微环境相关分子表达变化的影响。[结果]1.CT26细胞皮下注射成瘤率:CT26细胞注射组和PD-L1过表达CT26细胞注射组15天成瘤率分别为59.1%(26/44)、87.5%(14/16)。CT26细胞注射组15天成瘤率显著低于PD-L1过表达CT26细胞注射组(χ2=4.26,p＜0.05)。2.瘤体组织PD-L1的表达分析2.1瘤体组织PD-L1的逆转录聚合酶链式反应结果:以第一组(CT26皮下成瘤)PD-L1 mRNA的2-△△Ct值为(1.00±0.00),CT26皮下成瘤IFNγ瘤旁注射组(第五组)PD-L1表达倍数为(4.02±0.81),第二组(CT26皮下成瘤+PD-1抗体治疗组)和第六组(CT26皮下成瘤+IFNγ处理+PD-1抗体治疗组)表达倍数则分别为(0.19±0.23)和(0.42±0.28)。Balb/c荷瘤小鼠IFNγ瘤旁注射显著增加瘤体PD-L1 mRNA 的表达(p=0.000)。2.2瘤体组织PD-L1的蛋白质免疫印迹检测:微卫星稳定细胞皮下成瘤Balb/c鼠瘤体组织中观察到PD-L1蛋白的表达,外源性IFNγ处理引起了荷瘤小鼠瘤体组织PD-L1蛋白表达的进一步增加。2.3瘤体组织免疫荧光染色PD-L1检出率:CT26细胞皮下成瘤动物模型瘤体组织PD-L1的检出率为(42.83±6.05)%,IFNγ干预后瘤体组织PD-L1检出率为(58.33±3.50)%。外源性IFNγ作用显著增加了微卫星稳定结直肠癌瘤体组织中PD-L1的检出率(p=0.002)。2.4各组动物模型瘤体组织中,在肿瘤细胞和CD8+T淋巴细胞表面都观察到PD-L1分子的表达。3.瘤体组织STAT1/3和CXCL9的蛋白免疫印迹检测:与CT26细胞皮下注射Balb/c鼠瘤体比较,外源性IFNγ干预引起了荷瘤小鼠瘤体组织STAT1/3和CXCL9蛋白的表达增加。4.各实验组Balb/c荷瘤小鼠瘤体质量观察4.1各实验组瘤体质量:30d后,第一组至第六组瘤体质量分别为:(10.39±0.84)g、(0.14±0.15)g、(17.06±0.59)g、(0.28±0.13)g、(14.82±0.69)g、(0.21±0.08)g。IFNγ处理及PD-L1的过表达均引起Balb/c荷瘤小鼠瘤体质量的增加(p<0.001),且CT26细胞PD-L1过表达干预下的瘤体质量高于IFNγ皮下注射组(p=0.003);PD-1抑制剂治疗后,IFNγ处理组和PD-L1过表达CT26细胞成瘤组瘤体质量都明显减少(p<0.001)。4.2 PD-1mAb治疗引起的荷瘤Balb/c小鼠瘤体质量变化:PD-1mAb治疗后,在IFNγ注射组及PD-L1过表达干预组,荷瘤Balb/c小鼠瘤体质量减少幅度均明显高于CT26细胞皮下成瘤组。5.CD8、E-cadherin免疫荧光染色结果5.1 E-cadherin荧光染色:E-cadherin阳性CT26细胞的检出率在第一组(CT26皮下成瘤)、第二组(CT26皮下成瘤+PD-1抗体治疗组)、第五组(CT26皮下成瘤+IFNγ处理)和第六组(CT26皮下成瘤+IFNγ处理+PD-1抗体治疗组)分别为:(66.33±9.61)%、(13.67±3.79)%、(75.67±4.93)%和(15.33±2.51)%。PD-1mAb瘤旁注射治疗后,无论是否使用外源性IFNγ处理,均引起瘤体组织CT26细胞百分比大幅度下降(CT26细胞干预p=0.012;CT26细胞加IFNγ处理p=0.048)。5.2 CD8荧光染色:CD8+T淋巴细胞的检出率在第一组、第二组、第五组和第六组分别为:(33.67±3.79)%、(77.67±9.61)%、(12.00±3.00)%和(83.33±7.09)%。与第一组比较,外源性IFNγ诱导使CT26细胞皮下成瘤瘤体组织中CD8+T细胞检出率降低(p=0.004);PD-1mAb瘤旁注射治疗荷瘤Balb/c小鼠后,均引起瘤体组织CD8+T细胞百分比大幅度升高(CT26细胞干预p=0.021;CT26细胞加IFNγ处理p=0.005),且CT26细胞加IFNγ处理组CD8+T细胞百分比增加幅度显著高于CT26细胞干预组(p=0.023)。6.TUNEL分析:瘤体组织细胞凋亡率在第一组至第六组中分别为:(5.23±0.91)%、(30.67±5.13)%、(3.47±0.35)%、(29.33±4.04)%、(4.13±0.91)%和(24.33±5.03)%。与第一组比较,PD-L1过表达CT26细胞皮下成瘤瘤体组织中的细胞凋亡率显著降低(p=0.042),而外源性IFNγ处理虽然引起第五组荷瘤小鼠瘤体组织细胞凋亡率下降,但无统计学差异;PD-1mAb瘤旁注射治疗荷瘤Balb/c小鼠后,均引起各相应组瘤体组织细胞凋亡率显著下降(CT26细胞干预p=0.018;PD-L1过表达CT26细胞干预p=0.007;CT26+IFNγ处理p=0.026),但PD-1抗体治疗后各组间(第二组、第四组、第六组)瘤体组织细胞凋亡率并未观察到统计学差异;在各实验组中,特别是PD-1抑制剂治疗后的瘤体组织上,均观察到凋亡的CT26细胞。7.CT26细胞PD-L1过表达对PD-1抗体治疗引起的瘤体组织免疫微环境相关分子表达变化的影响:7.1 PD-1抗体免疫治疗后,肿瘤细胞PD-L1的过表达引起了肿瘤微环境中大多数适应性免疫相关分子转录水平的表达上调,且以CD8最为最高;CD4、IL-17A和LAG3的转录水平在PD-L1过表达的作用下表现为下调。CT26细胞PD-L1的过表达引起肿瘤微环境中CD8转录水平显著降低(mRNA相对表达变化倍数为0.37±0.25);PD-1抑制剂治疗后,CD8的转录水平表现出极大幅度的增加(mRNA相对表达变化倍数为16.49±2.19)。7.2 CD8的荧光染色结果:CD8荧光染色检出率在第一组至第四组中分别为:(12.67±2.08)%、(71.33±8.08)%、(5.00±1.00)%和(73.00±5.57)%。与第一组比较,PD-L1过表达CT26细胞皮下成瘤瘤体组织中CD8+ T细胞检出率显著降低(p=0.007);PD-1mAb瘤旁注射治疗荷瘤Ba1b/c小鼠后,均引起各组瘤体组织CD8+T细胞百分比大幅度升高(CT26细胞干预p=0.004;PD-L1过表达CT26细胞干预p=0.002),但PD-1抗体治疗后第二组、第四组瘤体组织CD8+T细胞百分率并未观察到统计学差异。PD-1mAb瘤旁注射后,PD-L1过表达CT26细胞皮下成瘤瘤体组织CD8+ T细胞百分率的增加幅度显著高于CT26细胞干预组(p=0.009)。[结论]结直肠癌属于由PD-1/PD-L1通路介导免疫逃逸的肿瘤;PD-1抗体治疗引起了以CD8+T淋巴细胞上调为主要表现的肿瘤微环境促炎方向的改变,并最终导致肿瘤细胞的凋亡和瘤体质量减少;IFNγ作为潜在的免疫治疗增敏剂,促进了微卫星稳定结直肠癌PD-1抗体免疫靶向治疗的效果,其机制可能与STAT1/3介导下肿瘤细胞PD-L1的表达、趋化因子CXCL9相关的CD8+T淋巴细胞募集有关。