解淀粉芽孢杆菌barnase-barstar分子调控系统的构建及在烟草花发育调控中的应用研究

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Barnase是一种来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的细胞致死因子,Barstar是Barnase的抑制因子,barnase-barstar构成一对分子开关可以应用于基因表达调控研究。barnase在花序分生组织中由花序分生组织特异启动子AtREM1启动表达能够使花序分生组织细胞死亡从而抑制植物开花,使植物不能进入生殖生长而长期处于营养生长状态。barstar的表达可以阻止barnase的致死作用,从而使植物恢复其育性进入生殖生长状态产生种子。Barstar由一个嵌合启动子MRE35S90启动,该基因的表达受到人工施加化学诱导剂铜离子的控制,当无化学诱导剂时该基因并不转录表达,当人工添加诱导剂时,该诱导剂与诱导剂作用基因ace1结合,从而使响应启动子启动barstar的表达。  本试验所构建的植物生殖器官调控系统可以在特定的时间和空间进行表达,可以根据人们不同的需要来进行人工控制。  本试验通过培养解淀粉芽孢杆菌,提取基因组,设计引物,通过PCR的技术手段获得了目的基因barnase及其抑制基因barstar;通过种植培养野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana),并通过提取其总基因组DNA,设计目的基因引物,获得花序分生组织特异型启动子AtREM1启动barnase的表达;通过培养野生豌豆(ViciaLinn),提取总基因组,设计引物,得到豌豆rbcs3A终止子;培养农杆菌通过PCR手段获得NOS终止子;培养酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)通过PCR获得ace1基因;人工合成MRE35S90启动子和CaMV35S启动子分别启动barstar和ace1的表达。  将获得的各基因组合获得重组表达质粒命名为RBCu,并将该重组质粒转化根癌农杆菌LBA4404,使用农杆菌侵染法转化优质烟草品种NC89从而获得转基因烟草。  转基因烟草的检测采用抗除草剂的筛选、普通PCR检测目的基因、Southernblot检测以及实时荧光定量PCR目的基因拷贝数等技术手段,从而在整合水平、转录水平和表达水平上对目的基因进行检测。  论文试验完成了解淀粉芽孢杆菌barnase-barstar调控系统的克隆,并构建了植物花发育受阻系统以及化学诱导植物花发育受阻恢复系统,证实了该分子调控系统的有效性。将该系统应用于其他植物中可以达到保护环境和提高经济作物或农作物产量的目的,在一定程度上推动经济的发展和人类社会的可持续发展。
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