【摘 要】
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目的:本实验通过建立H9c2心肌细胞氧化应激模型来模拟心肌氧化应激反应,探究定心藤生物碱5（S）-5-carboxystrictosidine（5-CS）是否具有抗氧化应激诱导H9c2心肌细胞凋亡的作用。如果有抗凋亡的作用,定心藤生物碱是否通过激活PI3K/Akt信号通路来抑制细胞凋亡进而减轻H2O2刺激诱导下的心肌细胞损伤。方法:1.建立氧化应激模型。实验分为五组,用完全培养基稀释H2O2后制备
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目的:本实验通过建立H9c2心肌细胞氧化应激模型来模拟心肌氧化应激反应,探究定心藤生物碱5（S）-5-carboxystrictosidine（5-CS）是否具有抗氧化应激诱导H9c2心肌细胞凋亡的作用。如果有抗凋亡的作用,定心藤生物碱是否通过激活PI3K/Akt信号通路来抑制细胞凋亡进而减轻H2O2刺激诱导下的心肌细胞损伤。方法:1.建立氧化应激模型。实验分为五组,用完全培养基稀释H2O2后制备成0、50、75、100、200μmol/L浓度梯度处理液,分别处理H9c2心肌细胞2 h。刺激结束后,MTS法检测各组细胞存活率,筛选出合适的H2O2浓度,建立稳定的氧化应激模型。2.通过MTS法和试剂盒检测定心藤生物碱5-CS对氧化损伤的H9c2心肌细胞保护作用细胞毒性分组:空白组（Control）、各浓度药物组（1、10、100、300μg/mL）。细胞活力实验分组:Control组、模型组（H2O2）、阳性药组（NAC+H2O2）、各浓度给药组（6、20、60、200μg/mL 5-CS+H2O2）。MTS法检测细胞存活率。氧化损伤指标检测实验分组:Control组、5-CS组、H2O2诱导组（2 h、8 h、24 h）、H2O2+5-CS组（2 h、8 h、24 h）,使用生化试剂盒检测CAT活力、MDA含量。3.通过流式细胞术检测氧化应激下H9c2心肌细胞凋亡情况凋亡实验分组:Control组、H2O2组、阳性药组（NAC+H2O2）、各浓度给药组（20、60、200μg/mL 5-CS+H2O2）,流式细胞术检测细胞凋亡情况。4.通过MTS法和流式细胞术检测阻断PI3K/Akt信号通路后定心藤生物碱5-CS对氧化应激下的H9c2心肌细胞活力及凋亡的影响细胞活力及凋亡实验分组:Control组、H2O2刺激组、H2O2+5-CS组、H2O2+5-CS+PI3K抑制剂组和H2O2+PI3K抑制剂组,MTS法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡情况。5.加抑制剂前后通过蛋白质印迹检测PI3K/Akt信号通路的相关关键蛋白Akt和p-Akt实验分组:Control组、5-CS组、H2O2诱导组、H2O2+5-CS组,H2O2诱导心肌细胞3 min、10 min、30 min后,WB检测p-Akt、Akt表达水平。之后根据结果选择H2O2作用合适的时间进行后面的实验,加抑制剂实验分组:Control组、H2O2刺激组、H2O2+5-CS组、H2O2+5-CS+PI3K抑制剂组和H2O2+PI3K抑制剂组。WB检测p-Akt、Akt表达水平。结果:1.药效作用H2O2刺激诱导H9c2心肌细胞损伤合适条件为:75μM H2O2刺激2 h。以此条件为基础进行接下来的药效实验。对细胞活力影响:与Control组比较,H2O2组细胞存活率明显下降,与H2O2组对比,各个浓度的给药组均能提高心肌细胞存活率,并且在药物浓度为60μg/mL时对心肌细胞的保护作用最好。对细胞抗氧化损伤能力影响:与Control组相比,H2O2组的CAT活力降低、MDA含量升高,与H2O2组对比,在H2O2处理时同时给予药物处理后能提高CAT活力、降低MDA含量,提高细胞的抗氧化能力。对细胞凋亡影响:相较于Control组,H2O2组在H2O2处理后显著的提高了心肌细胞的凋亡率,与H2O2组比较,各个浓度的给药组均能降低心肌细胞的凋亡率。2.机制作用对PI3K/Akt信号通路及p-Akt的影响:与药物处理组相比,加抑制剂组降低了因药物作用提升的心肌细胞存活率,同时提高了因给药处理后降低的心肌细胞凋亡率。与Control组比较,H2O2组（3 min）中p-Akt的蛋白表达显著下降,给药组相较于H2O2组（3 min）能提高心肌细胞中p-Akt的蛋白表达水平。同时加入抑制剂后降低了因给药处理后提升的p-Akt蛋白表达水平。结论:定心藤生物碱对氧化应激损伤的心肌细胞具有保护作用,此外定心藤生物碱对因氧化应激损伤所致的心肌细胞凋亡具有逆转作用,定心藤生物碱通过激活PI3K/Akt信号通路来抑制细胞凋亡进而减轻H2O2刺激诱导下的心肌细胞损伤。
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