吴茱萸是芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实。数百年前已有文字记载它能够用于治疗临床疾病,药用价值较高。吴茱萸碱是从吴茱萸中提取的一种吲哚喹唑啉类生物碱,具有保护心脏、降血压、减肥、抗炎、镇痛等多种药理活性。近年来,已经有研究发现吴茱萸碱具有抗肿瘤作用,它能够在体外抑制胃癌、肝癌、肺癌、肠癌等癌细胞的生长。但是,目前对吴茱萸碱抗肝癌作用的研究较为浅显、分散,对其抗肝癌作用的机制研究也较少。本课题拟对吴茱萸碱的抗肝癌作用做一个系统化的研究,同时对其作用机制进行初步的探讨,为进一步开发应用吴茱萸碱提供一定的理论和实验依据。目的:从整体和离体水平考察吴茱萸碱的抗肝癌作用,初步探讨与其作用相关的分子机制。方法:在整体水平,小鼠和裸鼠皮下接种H22和SMMC-7721肝癌细胞,建立肝癌异位移植瘤模型。将动物随机分为模型组、5-FU组和吴茱萸碱组。吴茱萸碱组灌胃给予吴茱萸碱20 mg/kg,体积为10 mL/kg,1次/d;5-FU组隔日腹腔注射给予氟尿嘧啶10 mg/kg,体积为10 mL/kg。给药期间,观察动物的一般情况,称取体重,测量瘤体积。实验结束后,剥取瘤组织,称取瘤重,进行病理组织学检查。ELISA法检测动物血清中AFP(Alpha fetoprotein)和 TSGF(Tumor specific growth factor)的水平。在细胞水平,采用 CCK8 法和细胞周期实验考察吴茱萸碱对HepG2和SMMC-7721细胞增殖的影响。通过DAPI染色和流式细胞术,检测吴茱萸碱对HepG2和SMMC-7721细胞凋亡的影响。另外,利用Transwell技术和划痕实验研究吴茱萸碱对HepG2和SMMC-7721细胞侵袭和迁移的作用。运用Western blot、qRT-PCR和免疫组织化学法检测人肝癌细胞HepG2和裸鼠瘤组织中相关蛋白和mRNA水平的变化。结果;在H22肝癌小鼠异位移植瘤模型中,5-FU组小鼠进食和饮水活动减少,毛色不均,大便稀溏,其他组小鼠均未见异常。吴茱萸碱组和5-FU组瘤体积、瘤重均降低,有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。血清指标检测结果表明,模型组小鼠血清AFP和TSGF水平较空白对照组显著性升高(P<0.01),5-FU组和吴茱萸碱组血清AFP和TSGF的水平与模型组比较显著性降低(P<0.01)。病理组织学检查结果表明,阳性组和吴茱萸碱组瘤组织坏死程度较模型组明显,少量瘤细胞"凋亡"。在H22肝癌裸鼠异位移植瘤模型中,给药期间,各组裸鼠生理状态和体重均未见异常。给予相应药物9 d后,5-FU组和吴茱萸碱组裸鼠瘤体积明显小于模型组(P<0.01)。5-FU组和吴茱萸碱组裸鼠瘤重均低于模型组,有显著性差异(P<0.01)。血清中AFP和TSGF的水平,5-FU组和吴茱萸碱组明显降低,与模型组比较,有显著性差异(P<0.01)。裸鼠皮下接种SMMC-7721细胞后,各组生理状态均未见异常。体重、瘤体积和瘤重均无统计学差异(P>0.05)。病理组织学检测发现,吴茱萸碱组肿瘤坏死程度较模型组明显,以凝固性坏死为主,其间可见轻微或轻度的"凋亡"样坏死。在离体水平,吴茱萸碱能够降低HepG2和SMMC-7721细胞的存活率,诱导细胞周期阻滞在G2/M期。DAPI染色结果显示,吴茱萸碱组细胞体积皱缩,染色质凝聚,10 μmol/L组中有部分细胞的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。HepG2和SMMC-7721细胞凋亡率分别升高至17.98%和14.64%,与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。另外,5 μmol/L的吴茱萸碱就能使Transwell侵袭和迁移的细胞数明显减少(P<0.01)。在诱导细胞凋亡方面,吴茱萸碱能够升高人肝癌细胞HepG2和瘤组织中cleaved-caspase3蛋白的表达水平,改变bax/bcl-2的比值,抑制p-Akt蛋白的表达。Akt激动剂SC79能够明显上调p-Akt和bcl-2蛋白的表达,抑制bax和cleaved-caspase3蛋白的表达。吴茱萸碱能够明显阻滞SC79引起的p-Akt、bcl-2、bax和cleaved-caspase3蛋白的变化。LY294002和吴茱萸碱均能减弱p-Akt蛋白的表达,与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。在抑制侵袭、迁移方面,吴茱萸碱能够抑制HepG2和瘤组织中β-catenin蛋白和mRNA水平的表达。吴茱萸碱组Frizzled-7和p-GSK3β蛋白的表达受到抑制,APC蛋白的水平上调。转染Frizzled-7高表达质粒的HepG2细胞Frizzled-7和β-catenin蛋白的表达均上升。吴茱萸碱能够抑制Frizzled-7高表达质粒引起的Frizzled-7和β-catenin蛋白的表达升高。结论:1.吴茱萸碱能够抑制动物肝癌异位移植瘤的生长。2.吴茱萸碱能够抑制肝癌细胞活性,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,抑制侵袭和迁移。3.吴茱萸碱诱导肝癌细胞凋亡作用可能与抑制Akt蛋白的表达有关。4.吴茱萸碱可能通过Frizzled-7调控β-catenin的表达,影响Wnt通路,抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。