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车前子为常用中药,最早记载于《神农本草经》,被列为上品。中国药典规定车前子为车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd.的干燥成熟种子。车前子具有清热利尿,渗湿通淋,明目,祛痰功效,现代临床中,车前子及其复方多用于治疗高血压、水肿、糖尿病等疾病。但是对于车前子药效物质基础研究及质量标准研究却鲜有报道。2005年版药典中车前子的质量标准仍然停留在性状描述和显微鉴别等形态鉴别的水平。本论文针对中药成分的复杂性和多成分多靶点的作用特点,从化学成分、药效评价及质量标准等方面对车前子进行系统研究,为阐明其药效物质基础、建立质量标准提供科学依据。本论文为其他具有降压、利尿功效的中药药效评价及质量标准研究提供借鉴。
1.化学成分研究
综合运用多种分离纯化和结构鉴别手段,对车前子进行了化学成分研究。从车前子乙醇提取物中分离并鉴定了13个化合物,其中包括3个新胍类化合物,分别为(R)-2-((S)-2-iminoimidazolidin-4-yl)-6-methylhept-5-enoic acid(CQ-1)、(R)-6-hydroxy-2-((S)-2-iminoimidazolidin-4-yl)-6-methylheptanoic acid(CQ-2)和(R)-2-((S)-2-iminoimidazolidin-4-yl)-6-methoxy-6-methylheptanoic acid(CQ-3);苯乙醇苷类4个,分别为acteoside(CQ-4),isoacteoside(CQ-5),PlantainosideD(CQ-6)和plantamajoside(CQ-7);环烯醚萜类2个,分别为geniposidic acid(CQ-8),aucubin(CQ-9);其他类化合物4个(CQ-10-13)。胍类化合物CQ-1-3为结构新颖的的新化合物,苯乙醇苷类和环烯醚萜类化合物分别为车前子中含量较高的两大类成分。
2.基于生物质谱分析的车前子及其主要成分的药效学研究
车前子的传统功效为降压、利尿,这些疾病的发生机制与肾素-血管紧张素系统的调控功能、肾小球滤过率等重要指标密切相关。本论文采用了基于UPLC-MSn生物质谱分析的药效评价模式,考察车前子及其主要成分对血管紧张素网络调控,并讨论该机制与其改善肾功能、糖代谢的相关性。
首次建立的UPLC-MSn生物质谱技术药效评价方法主要有:①血清中血管紧张素的UPLC-MS/MS定量分析方法。评价药物对肾素-血管紧张素系统的调控作用,揭示其降压作用的机制。②血管紧张素转化酶抑制活性的UPLC-MS定量分析方法。通过对血管紧张素转化酶活性的测定,筛选降压药物,并研究药物的作用机制。③生物样品中尿素和肌酐的UPLC-MS/MS定量分析方法。通过准确、快速地反应药物对肾小球滤过率的影响,评价药物对肾排泄功能的作用。
在上述生物质谱评价方法研究的基础上,结合常规药效学评价,对车前子乙醇提取物、富集部位、胍类化合物、苯乙醇苷类和环烯醚萜类及其主要成分的降压、利尿、降糖作用及机理进行深入探讨,以阐明车前子药效物质基础。
降压作用:分别考察了车前子不同提取物对链脲佐菌素结合高脂饲料造模大鼠动脉收缩压和血管紧张素系统的影响。结果表明,给药6周后,车前子乙醇总提取物组大鼠动脉收缩压下降,血清中血管紧张素Ⅱ含量下降、缓激肽含量上升,说明车前子总提取物具有降压作用,可能通过调控血管紧张素代谢而发挥作用;车前子麦角甾苷和plantagoamidinic acid A的富集部位也表现出相同作用。进一步对车前子提取物及单体化合物体外血管紧张素转化酶抑制活性进行筛选,其中,车前子乙醇总提取物组及麦角甾苷等4个苯乙醇苷类化合物均表现出显著的抑制作用。因此确定麦角甾苷和plantagoamidinic acid A为车前子降压作用的主要有效成分,可能通过调节血管紧张素系统及抑制血管紧张素转化酶活性来实现的。
利尿作用:采用大鼠水负荷模型,研究车前子乙醇总提取物、麦角甾苷和京尼平苷酸对大鼠排尿量和尿中Na+、K+、Cl-离子排泄量的影响。车前子乙醇提取物和麦角甾苷均能增加4 h内大鼠排尿量以及尿中Na+、K+、Cl-离子含量,发挥利尿作用,其中,麦角甾苷为车前子利尿的主要有效成分。
降糖作用:分别通过四氧嘧啶致糖尿病小鼠及HepG2细胞糖代谢实验研究表明plantagoamidinic acid A、麦角甾苷和京尼平苷酸为车前子中发挥降糖作用的活性成分。
3.车前子及盐车前子的质量评价研究
在化学成分与药效评价基础上,分别建立了以有效成分麦角甾苷和京尼平苷酸为指标的车前子药材和盐车前子饮片TLC鉴别和HPLC含量测定方法,起草了车前子及盐车前子的质量标准,己为中国药典(2010版)收载。
建立了车前子的UPLC-TOF-MS指纹图谱,分析并比较了两种基原植物车前与平车前种子、车前子与盐车前子在成分上的异同。通过对18批药材及饮片的指纹图谱分析,共鉴定了麦角甾苷、京尼平苷酸、plantagoamidinic acid A等49个成分为两种车前子的共有成分。UPLC-TOF-MS指纹图谱为车前子质量评价提供了准确、有效的依据。