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研究背景：阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种常见的与年龄相关的中枢神经系统退行性疾病。老年斑是AD的主要病理特征之一，β-淀粉样蛋白(β-Amyloid Protein，Aβ)是老年斑的主要成分，它是AD形成和发展的关键因素。Aβ通过多种途径引发神经毒性作用。体内外实验均证实：Aβ可导致线粒体功能障碍。大量证据表明：线粒体在AD发病过程中起重要作用。褪黑素(melatonin)是松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，具有广泛的生理作用。褪黑素在衰老及神经退行性疾病方面的作用已受到广泛关注。褪黑素具有亲脂性和亲水性的双重特性，能穿过细胞膜，较易到达包括线粒体在内的任何细胞器，并且能以较高浓度聚集在线粒体内。褪黑素可与脂质双分子层结合，稳定线粒体内膜，提高电子传递链活性。褪黑素可改善多种因素导致的线粒体功能障碍。有研究报道：不同年龄阶段AD转基因模型小鼠Tg2576应用褪黑素补充治疗，其作用差异较大。在老年鼠，褪黑素抗Aβ和抗氧化效果不明显。而在年轻鼠，褪黑素具有较好的抗Aβ和抗氧化效果。我们前期在快速老化痴呆模型鼠SAMP8上的研究结果也证实：褪黑素对SAMP8小鼠学习记忆力的改善存在年龄差异，对年轻鼠效果较好，而对老年鼠效果不明显。基于以上研究结果，我们推测：褪黑素对体外Aβ所致不同衰老程度神经元损害的保护作用可能也存在差异，该作用差异可能与褪黑素对不同衰老程度神经元线粒体保护作用不同有关。本课题将对这一推测开展研究，为临床应用褪黑素防治AD提供理论基础。
第一部分：长时程海马神经元培养中细胞衰老与线粒体功能关系的研究。
目的：⑴观察长时程原代海马神经元培养过程中，神经元衰老情况。⑵观察长时程原代海马神经元培养过程中，线粒体功能变化情况。⑶确定长时程培养过程中，出现具有线粒体功能障碍的典型衰老特征的时间。
方法：①体外长时程海马神经元培养，以倒置相差显微镜观察细胞生长情况。②采用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色，对培养5、10、15、20、25和30天的海马神经元染色，显微镜观察，计数。③以荧光探针罗丹明123染色，通过流式细胞仪检测神经元的线粒体膜电位。④以荧光探针DCFH-DA染色，通过流式细胞仪检测细胞内活性氧水平。⑤透射电镜观察培养神经元的线粒体形态。⑥采用SPSS11.0 for Windows统计软件进行数据分析。所得数据以均数±标准差(-x±s)表示，用单因素方差分析进行均数间的多重比较，以P＜0.05表示有统计学意义。
结果：⑴生长期(培养0-10天)：该期内神经元胞体逐渐增大，变饱满，突起逐渐长出，直至分支明显延长，相互交织成网络。⑵随着培养时间的延长，衰老神经元的数目逐渐增多，培养5、10、15、20、25和30天的衰老神经元占所观测神经元的百分比分别是6％、32％、53％、79％、90％和93％。⑶随着培养时间的增加，神经元的线粒体膜电位逐渐降低。培养5、15、20、25和30天的线粒体膜电位水平分别是培养10天海马神经元的102.2％、89.2％、72.1％、70.4％和58.5％。⑷培养时间的延长，细胞内活性氧水平逐渐升高，培养5、15、20、25和30天的细胞内活性氧水平分别是培养10天海马神经元的83.0％、139.8％、148.9％、178.2％和215.4％。⑸电镜结果显示：培养10天海马神经元的线粒体结构正常，具有双层膜，线粒体嵴平行排列。培养25天海马神经元的大多数线粒体肿胀，只有少数正常的线粒体，线粒体嵴数目变少及空泡形成。
结论：①长时程海马神经元培养可用于细胞衰老的研究。②长时程海马神经元培养过程中，线粒体功能逐渐降低，与衰老程度呈正相关。③培养第25天的海马神经元具有线粒体功能障碍的典型衰老特征。
第二部分：褪黑素对体外Aβ诱导不同衰老程度海马神经元线粒体功能障碍的保护作用差异。
目的：⑴观察褪黑素对体外Aβ诱导不同衰老程度海马神经元损害的保护作用。⑵揭示褪黑素对体外Aβ诱导不同衰老程度神经元的保护作用差异是否与褪黑素对线粒体作用不同有关。
方法：①基于第一部分的研究结果，我们选择培养第10天和25天的海马神经元分别代表年轻神经元和衰老神经元。MTT法测定海马神经元的细胞活力。②以荧光探针罗丹明123染色，通过流式细胞术检测线粒体膜电位。③采用反相高效液相色谱法检测细胞内ATP水平。④通过紫外分光光度法检测线粒体呼吸链复合物活性。⑤采用SPSS11.0 for Windows统计软件进行数据分析。所得数据以均数±标准(-x±s)表示，用单因素方差分析进行均数间的多重比较，以P＜0.05表示有统计学意义。
结果：⑴MTT结果显示：培养10天海马神经元，Aβ25-35组细胞活力较对照组降低(P＜0.05)，而褪黑素预处理组细胞活力高于Aβ25-35组(P＜0.05)；培养25天海马神经元，Aβ25-35组细胞活力较对照组降低(P＜0.05)，褪黑素预处理组(10-5-10-7)细胞活力与Aβ25-35组相比分别升高3.9％、2.6％和1.2％，差异无统计学意义(P＞0.05)。⑵流式细胞术检测结果：培养10天海马神经元，Aβ25-35组细胞线粒体膜电位较对照组降低(P＜0.05)，而褪黑素预处理组线粒体膜电位高于Aβ25-35组(P＜0.05)；培养25天海马神经元，Aβ25-35组细胞线粒体膜电位较对照组降低(P＜0.05)，褪黑素预处理组线粒体膜电位与Aβ25-35组相比升高11.5％，差异无统计学意义(P＞0.05)。⑶反相高效液相色谱法检测结果提示：培养10天海马神经元，Aβ25-35组细胞ATP含量较对照组降低(P＜0.05)，而褪黑素预处理组细胞ATP含量高于Aβ25-35组(P＜0.05)；培养25天海马神经元，Aβ25-35组细胞ATP含量较对照组降低(P＜0.05)，褪黑素预处理组细胞ATP含量与Aβ25-35组相比升高12.8％，差异无统计学意义(P＞0.05)。⑷分光光度法检测结果显示：Aβ25-35诱导年轻和衰老海马神经元线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性均下降(P＜0.05)；褪黑素预处理可改善Aβ25-35诱导的年轻神经元线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ活性降低，但对Aβ25-35所致的衰老神经元线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ活性下降无明显作用(P＞0.05)。褪黑素预处理对Aβ25-35所致年轻和衰老神经元线粒体呼吸链复合物Ⅱ和Ⅲ的活性降低均无明显影响。单纯应用褪黑素不能提高年轻神经元线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ活性，但可改善衰老海马神经元线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ活性。单纯应用褪黑素对年轻和衰老神经元线粒体呼吸链复合物Ⅱ和Ⅲ活性均无明显影响。
结论：①褪黑素对体外Aβ25-35诱导年轻和衰老海马神经元损害的保护作用不同，即褪黑素对Aβ25-35诱导年轻海马神经元的损害有保护作用，而对Aβ25-35诱导衰老海马神经元的损害无明显影响。②褪黑素可改善Aβ25-35诱导年轻海马神经元的线粒体功能损害(线粒体膜电位下降，ATP含量降低及线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ活性降低)，但对Aβ25-35诱导衰老海马神经元的线粒体功能损害无明显作用。③褪黑素对Aβ25-35诱导年轻和衰老海马神经元损害的保护作用差异可能与褪黑素对年轻和衰老神经元线粒体的作用不同有关。