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背景与目的血管生成是指已存在的血管以芽生的方式形成新生血管的过程。通过微血管网络的形成,以保证细胞获得充足的氧气及营养物质,协助清除代谢产物从而满足局部代谢的需求。血管生成这一过程在促进创伤愈合、缺血性疾病的治疗及通过抑制肿瘤血管生成在抗肿瘤治疗中发挥重要的作用。目前研究表明可通过使用各种外源性血管生成相关因子来调控血管生成,但由于药物毒性、诱导机体耐药性及（或）药物性稳定性差等不利因素限制了其广泛应用。因此如何安全、高效的调控血管生成是有待解决的问题之一。间充质干细胞（mesenchymal stem/stromal cells,MSCs）作为组织再生及肿瘤生物学治疗中理想的种子细胞,可通过胞外囊泡介导的旁分泌机制发挥良好的治疗作用。外泌体作为胞外囊泡的一类,凭其优越的生物学性能及其在细胞间通讯、药物传递中的重要作用引起了学者们的广泛关注。目前研究表明MSCs来源的外泌体在调控血管生成中的作用呈现多样化且富有争议。对于不同组织来源的MSCs,其外泌体在调控血管生成的作用并不相同,甚至同一组织来源的MSCs在不同的培养条件下其外泌体所包裹的内容物也随之发生变化,进而影响血管生成的过程。人脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells of human deciduous exfoliated teeth,SHED）是2003年最先从人脱落乳牙的牙髓组织中发现的一类未分化的,具有高度增殖能力、多向分化潜能及自我更新能力的MSCs。目前传统体外细胞培养的氧气浓度为21%,明显高于体内生理条件下的氧气浓度。在乳恒牙替换过程中随着乳牙牙根的不断吸收,牙髓组织中的血管随之减少,乳牙牙髓干细胞处于相对乏氧的微环境中。因此本研究选取人脱落乳牙牙髓干细胞,通过2%氧气浓度预设来模拟体内乏氧微环境,旨在探讨常氧及乏氧条件下SHED来源外泌体对血管生成的调控作用,并借助外泌体miRNAs测序技术,探究其潜在的分子机制,以期为安全高效的调控血管生成提供新的思路。方法1.常氧及乏氧SHED来源外泌体的比较分析从人脱落乳牙的牙髓组织中提取并培养乳牙牙髓干细胞。利用流式细胞术对细胞表面的标志物进行鉴定并通过成骨诱导茜素红染色实验验证SHED细胞的成骨分化能力。分别收集常氧（21%02）及乏氧（2%02）培养条件下的细胞上清并提取外泌体。借助透射电镜、电子粒径分析及Western blot实验对常氧SHED来源的外泌体进行鉴定。此外,通过透射电镜及电子粒径分析比较常氧外泌体（exosomes from SHED cututured at nomaxia,Norm-exos）及乏氧外泌体（exosomes from SHED cututured at hypoxia,Hypo-exos）的形态及粒径大小。然后利用双辛丁酸法（bicinchoninic acid assay,BCA）蛋白浓度测定试剂盒测定常氧及乏氧条件下等量细胞上清中外泌体的浓度。最后用PHK67荧光染料标记Norm-exos及Hypo-exos进行内吞实验,观察这两种外泌体能否被人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）所内吞。2.常氧及乏氧SHED来源外泌体对内皮细胞血管生成影响的体外研究首先,通过细胞增殖毒性检测（cell counting kit-8,CCK-8）实验及Ki67免疫荧光染色实验验证Norm-exos及Hypo-exos对内皮细胞增殖能力的影响。此外,借助细胞划痕实验及Transwell小室实验检测Norm-exos及Hypo-exos对内皮细胞迁移能力的影响。最后,通过基质胶体外成管实验验证Norm-exos及Hypo-exos对内皮细胞体外成管能力的影响,并用Western blot实验检测内皮细胞中促血管生成相关因子的表达变化。3.常氧及乏氧SHED来源外泌体对内皮细胞血管生成影响的体内研究首先,通过鸡胚尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）实验来验证Norm-exos对血管生成的影响。于7～8日龄鸡胚的气室尿囊膜中央滴入Norm-exos或等量PBS缓冲液后观察血管生长情况。此外,将人舌鳞状细胞癌细胞系（centre antoine lacassagne 27,CAL27）细胞注射至裸鼠皮下局部成瘤,建立异种移植口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）模型。于瘤体基底部多次多位点注射Norm-exos或等量PBS,定期测量瘤体大小并将取出的瘤体组织进行CD31免疫组化染色。最后,通过裸鼠皮下基质胶成管实验来验证Norm-exos及Hypo-exos对体内血管生成的影响。将血管内皮细胞与已预冷融化的基质胶混匀,分别加入Norm-exos及Hypo-exos后注射至裸鼠背部皮下组织。10天后将小鼠处死取出基质胶栓观察并拍照记录,将基质胶栓进行促血管生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）免疫荧光染色及CD31免疫组化染色。4.常氧及乏氧SHED来源外泌体调控血管生成的机制探究分别将来自三个不同个体的SHED细胞于常氧及乏氧条件下培养,收集细胞上清提取外泌体,进行外泌体miRNAs测序。首先,将Norm-exos中的miRNAs按表达量从高到低进行排序并筛选出表达量排在前15位的miRNAs。通过查阅相关文献并通过qRT-PCR实验比较Norm-exos及SHED细胞中miR-1 00-5p及miR-1246的表达水平。另一方面,比较Hypo-exos及Norm-exos差异miRNAs,筛选出Hypo-exos中表达显著增加且差异倍数在2倍以上的miRNAs,用qRT-PCR实验比较所筛选出miRNAs在Norm-exos及Hypo-exos中的表达水平。最后,用转染所筛选出miRNAs合成物的血管内皮细胞进行基质胶体外成管实验,通过qRT-PCR实验及Western blot实验验证所筛选miRNAs的相关生物信号通路。结果1.常氧及乏氧SHED来源外泌体的比较分析SHED细胞呈成纤维细胞样的长梭形,细胞表面标志物的表达符合MSCs的特点且具有成骨分化能力。通过透射电镜、电子粒径分析及Western blot实验表明常氧SHED来源的微囊泡是外泌体。Norm-exos及Hypo-exos均呈类圆形的双膜结构,粒径大小在30～200 nm范围内,但Hypo-exos的平均粒径值显著大于Norm-exos的平均粒径值。此外,SHED细胞乏氧预处理后外泌体浓度显著增加。最后,发现PHK67荧光染料所标记的Norm-exos及Hypo-exos均能被内皮细胞所内吞。2.常氧及乏氧SHED来源外泌体对内皮细胞成血管影响的体外研究CCK-8实验及Ki67免疫荧光染色实验表明,与PBS对照组相比Norm-exo能显著抑制HUVECs的增殖及迁移能力。与Norm-exos相比,Hypo-exos能显著促进内皮细胞的增殖及迁移能力。此外,基质胶体外成管实验表明Norm-exos抑制内皮细胞的体外成管能力并负向调控促血管生成相关因子VEGF、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）及血管生成素 1（angiopoietin 1,ANGPT1）的表达。与PBS及Norm-exos相比,Hypo-exos显著促进内皮细胞的体外成管并正向调控内皮细胞中VEGF的表达。3.常氧及乏氧SHED来源外泌体对血管生成影响的体内研究鸡胚尿囊膜实验表明Norm-exos滴入点周围微血管的数量显著少于PBS对照组。此外,通过OSCC瘤体基底部多次多位点注射Norm-exos发现瘤体体积显著小于PBS对照组,并且Norm-exos治疗组中CD31阳性细胞所示微血管的数量显著减少。此外,裸鼠皮下基质胶成管实验表明Hypo-exos组的基质胶栓较Norm-exos组呈现出更红的外观且Hypo-exos组的VEGF表达量及CD31阳性细胞所标记微血管的数量显著增加。4.常氧及乏氧SHED来源外泌体调控血管生成的机制探究根据Norm-exos中miRNAs的测序结果筛选出表达量排在前15位的miRNAs。根据查阅相关文献并用qRT-PCR实验验证,结果表明Norm-exos中富集了更多的miR-100-5p及miR-1246。此外,通过比较 Hypo-exos 与 Norm-exos 中差异 miRNAs 并通过qRT-PCR实验验证,结果表明Hypo-exos中富集了更多的let-7f-5p与miR-210-3p。随后,通过基质胶体外成管实验、qRT-PCR实验及Western blot实验进行相关分子通路的验证。结果表明Norm-exos富集miR-100-5p及miR-1246通过负向调控VEGF的表达抑制血管生成,这与miR-100-5p/mTOR/HIF-1a及miR-1246/ACE信号通路相关。Hypo-exos通过富集let-7f-5p及miR-210-3p促进血管生成,这与let-7f-5p/AGO1/VEGF及miR-210-3p/EphrinA3信号通路相关。结论1.Norm-exos及Hypo-exos在调控血管生成中的作用不同。Norm-exos与PBS对照组相比抑制体内外血管生成,Hypo-exos与Norm-exos相比能显著促进体内外血管生成。2.常氧及乏氧条件通过调控乳牙牙髓干细胞来源外泌体中不同miRNAs的表达水平来调控血管生成。3.Norm-exos中富集更多的miR-100-5p及miR-1246,通过负向调控VEGF表达抑制血管生成,这与miR-100-5p/m TOR/HIF-1a及miR-1246/ACE信号通路相关。4.Hypo-exos 通过富集let-7f-5p及miR-21 0-3p促进血管生成,这与let-7f-5p/AGO1/VEGF及miR-210-3p/EphrinA3信号通路相关。