目的:将体外培养提纯的胎兔雪旺细胞种植到经化学处理的脱细胞同种异体神经段中制成桥接复合体。然后将桥接复合体移植到兔缺损的坐骨神经上,观察坐骨神经的再生及功能恢复情况。从而证实种植雪旺细胞的神经桥接复合体不仅能为再生神经提供良好的支架作用,又能够诱导和促进神经轴突和髓鞘的再生。与未种植雪旺细胞的神经桥接体相比,对坐骨神经缺损后的再生有更加有效的促进作用。从而为临床修复神经缺损提供实验基础理论。方法:1、胎兔雪旺细胞的培养:取怀孕28天的新西兰白兔,处死后迅速取胎兔。在手术显微镜下无菌条件下取胎兔双侧坐骨神经,尽可能剥除神经外膜及束膜后将其剪碎。采用双酶消化法(trypsin/collagenase)和双差速贴壁法培养和提纯雪旺细胞,并辅以神经生长因子(NGF)促进雪旺细胞的生长。倒置相差显微镜下观察雪旺细胞的生长情况,并接种进行传代,收集生长良好的第二代细胞计数并应用S-100蛋白免疫组化鉴定。2、去细胞神经桥接体的制备:取成年健康新西兰白兔,自梨状肌下缘以远切取双侧坐骨神经,作为同种异体神经的来源。手术显微镜下去除其表面的脂肪组织及部分神经外膜,并将其分为每段3厘米。首先4℃蒸馏水中静置6h,再将神经段放入3% Triton X-100 (聚氧乙烯辛烷基酚)中静置12h,然后置蒸馏水中震荡漂洗6h。如此反复,Triton X-100共作用时间为96h。对萃取的神经段行石蜡切片HE染色及扫描电镜观察去细胞的情况。3、种植雪旺细胞的同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损的实验观察:健康成年新西兰白兔(由河北医科大学实验动物中心提供)36只,随机分为两组,每组18只,将培养的第二代雪旺细胞以1×108/ml的浓度用100μl的微量注射器注入神经段内,然后将神经段迅速移植到兔缺损的一侧坐骨神经(实验组),对照组移植未注入雪旺细胞的去细胞同种异体神经,术后4周,8周,12周大体观察兔的足部溃疡形成及愈合情况。通过肌电图、光镜、电镜等方法检测坐骨神经轴突及髓鞘的再生及功能恢复情况,并应用SAS统计软件对神经传导速度及再生神经纤维数目作统计学处理,两组比较采用t检验,判断两组之间结果有无统计学意义(P<0.05具有统计学意义)。结果:1、雪旺细胞的培养与观察:经传代的雪旺细胞倒置相差显微镜下计数并观察细胞形态:雪旺细胞的浓度已达到1×108/ml,其典型形态呈梭形,有突起,多为双极,偶见三个细胞突起。胞核明显,呈卵圆形。细胞呈端对端、肩并肩、漩涡状或栅栏样排列生长。内仍可见少量成纤维细胞,胞体较雪旺细胞大,扁平状外形不规则,突起短而多,核仁明显,有2到3个核仁,颜色较雪旺细胞浅。2、去细胞神经桥接体的观察:一般性状观察:神经萃取过程中可见两端及周围有絮状物析出,萃取后神经呈淡乳白色,无光泽,其外径及长度较新鲜神经稍减小,柔软,有韧性。HE染色观察:神经纤维结构消失,红染的神经内膜呈波浪状纵形排列,形成管柱状空隙。扫描电镜观察:神经内的轴突、髓鞘已被完全去除,可见由胶原纤维构成的立体管状结构,部分管腔不规则。胶原纤维仍维持原有的位置、形态及结构特征,管内并可见膜样结构,为雪旺细胞基底膜。3、种植雪旺细胞的同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损的实验观察:术后4周、8周、12周两组动物手术区局部均未出现明显的排斥反应,实验组足部溃疡愈合情况、髓鞘及再生神经的超微结构均优于对照组。神经传导速度(NCV)于术后4周时,两组均未见明显的神经传导,术后8周、12周两组间统计结果有显著差异P<0.05,实验组优于对照组。神经纤维数目于术后4周、8周、12周两组间统计结果均有显著差异P<0.05,实验组优于对照组。结论:采用双酶消化法和双差速贴壁法培养和提纯雪旺细胞并辅以神经生长因子(NGF)可获取足够浓度的雪旺细胞。用3%Triton X-100作用96小时后可去除周围神经中的细胞和髓鞘而保留完整的基底膜管和纤维支架结构。种植雪旺细胞的去细胞同种异体神经复合体不仅能够能为再生神经提供良好的支架作用,又能够诱导和促进神经轴突和髓鞘的再生,对坐骨神经缺损后的再生有更加有效的促进作用。