PCR-反向点杂交法检测HBV基因型和耐药突变的应用研究

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研究目的:对HBV基因型(国内最常见的B、C和D三种型别)及4种核苷(酸)类药物的耐药突变位点(野生型:rt180L、rt204M、rt207M、rt207V、rt181A、rt236N;突变型:rt180M、rt204V、rt204I、rt207I、rt181V、rt236T)进行检测,以了解HBV基因型别分布情况、HBV耐药突变情况、HBV患者或携带者耐药情况、HBV基因型别与HBV DNA载量的关系以及PCR-反向点杂交法检测HBV基因型和耐药突变的方法学性能。研究方法:采用PCR-反向点杂交法对2012年10月-2013年9月期间在我院门诊和住院的接受核苷(酸)类药物治疗的424例乙型肝炎患者或携带者进行HBV基因型和耐药突变位点检测,并随机抽取50例经PCR-反向点杂交法检测为阳性的标本进行DNA序列测定,以评价PCR-反向点杂交法检测HBV基因型和耐药突变的方法学性能。数据统计学分析采用SPSS19.0软件。研究结果:在424例乙肝患者或携带者中,检出基因型别364例,未检出基因型别60例,其中有5例未检出基因型别,但检出野生型位点。HBV B型250例(58.96%),HBVC型92例(21.07%),HBV D型1例(0.24%),HBVB/C混合型13例(3.07%),HBVB/D混合型8例(1.89%)。检出耐药突变位点的有76例,rt180M检出率21.30%,rt204V检出率24.07%,rt204I检出率33.33%,rt181V检出率11.11%,rt236T检出率8.33%。对核苷(酸)类药物的耐药情况,B型耐药的有37例,其耐药率为40.22%,C型耐药的有17例,其耐药率为18.48%;B/C混合型耐药9例,其耐药率为69.23%;B/D混合型耐药4例,其耐药率为80.00%,经x2检验B和C型两组病例的耐药情况(x2=9.694,P=0.0021,P<0.05),差异具有统计学意义。B、C型的HBV DNA载量(Log10)分别为5.69±1.70和5.79±1.51,无明显差异(t=-0.449,P>0.05)。与DNA测序法比较,PCR-RDB法检测HBV基因型和耐药突变基因的敏感度、特异度和准确度为98.19%、100%、99.56%,阳性预测值为100%、阴性预测值为99.41%、阳性似然比为∞、阴性似然比为0.018,两种方法检测结果一致性极好(Kappa值为0.958),符合率为98.12%(109/111),差异无统计学意义(χ2=45.97,p=0.000)。研究结论:1、HBV感染以HBV B和HBV C型为主,同时存在一定比例的B/C、B/D混合型,耐药突变位点检出率从高到低依次为rt204I、rt204V、rt180M、rt181V、rt236T、rt207I。2、HBV B、C型对核苷(酸)类药物的耐药情况存在差异,前者高于后者。对二种药物联合耐药者发生率高,但三重耐药者不多。3、HBV B和C型患者HBV DNA载量无明显差异。4、PCR-反向点杂交法检测HBV基因型和耐药突变基因位点的敏感度、特异度和准确度都能满足临床检测要求,且操作简便,结果快速,适合临床实验室使用。
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