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本研究以低等无脊椎环节动物门的典型模式动物——日本刺沙蚕Neanthes japonica为研究对象,采用本实验室CP(Colophony–Paraffin)包埋切片专利技术结合免疫组织化学技术(SP法)及cDNA末端快速克隆(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,阐述了芳香族氨基酸羟化酶(aromatic amino acid hydroxylase,AAAHs)家族中三种羟化酶即色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)、苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH),以及多巴胺β羟化酶(dopamine-beta-hydroxylase,DβH)、苯乙醇胺-N-甲基转移酶(phenylethanolamine-N-methyltransferase,PNMT)在其中枢神经系统(主要是脑)内的表达和分布情况,对芳香族氨酸羟化酶与单胺类神经递质之间的关系进行了分析与讨论,并分析与探讨芳香族氨基酸羟化酶的基因进化节点问题,获得以下主要结论:1.应用羊抗TPH多克隆抗体和兔抗5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)抗血清,通过对日本刺沙蚕Neanthes japonica大脑和腹神经索连续和相邻切片进行免疫组织化学染色,结果表明5-HT表现出较强的阳性免疫反应,而TPH的阳性免疫反应较弱。5-HT和TPH的同步阳性免疫反应体现出广泛和一致的分布模式,TPH呈免疫阳性反应神经元细胞的类型、分布和投射与5-HT阳性免疫反应神经元细胞是相一致的,TPH和5-HT共定位于同一细胞的相同位置,具有共定位的现象存在。因此,TPH和5-HT互为判定中枢神经系统5-HT能神经元标记物,同时也从蛋白质水平证明了TPH在日本刺沙蚕中枢神经系统内的存在。应用RACE克隆技术对日本刺沙蚕中枢神经系统内的神经型TPH全序列进行了克隆,通过构建基因进化树,进行系统进化分析,证明神经型TPH在基因水平的存在,为AAAHs中tph和pah基因分化的节点由节肢动物门向前推进到环节动物门提供了证据。2.应用鼠抗PAH多克隆抗体,通过对日本刺沙蚕Neanthes japonica大脑连续切片进行免疫组织化学染色,结果表明鼠抗PAH多克隆抗体在全脑中均标记出大量伴随长长投射发出的蝌蚪状神经元细胞,而且在中脑和后脑的中央神经区也布满了静脉曲张样的神经纤维,对以往应用兔抗PAH多克隆抗体的标记结果进行了很好的补充。该结果中也推翻了以前根据兔抗PAH多克隆抗体标记结果所做出的关于PAH只能在细胞液中使苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)转变为酪氨酸(tyrosine,Tyr),而不需要分泌到胞外远端去发挥作用的假设。PAH在全脑的分布情况说明PAH既可以在神经元细胞内催化苯丙氨酸转变为酪氨酸,也可以分泌到远端(主要是中脑和后脑的中央神经区)去发挥作用。PAH的免疫组化标记结果说明在低等的环节动物日本刺沙蚕Neanthes japonica体内PAH和TPH已经各自分化为独立基因,有各自独立的表达产物,进一步证实了tph和pah基因分化的节点可能存在于环节动物门。3.应用兔抗TH多克隆抗体,通过对日本刺沙蚕Neanthes japonica大脑连续切片进行免疫组织化学染色,结果表明TH在全脑中均有分布,其分布形式与TPH和5-HT相似,但却又不完全相同,与PAH在脑内的分布特点也不一样。根据TH是多巴胺能(Dopaminergic)神经元细胞良好标记物的观点,由免疫组织化学结果分析可知多巴胺能神经元细胞在全脑的额切片中均有分布,但强阳性免疫反应多巴胺能神经元细胞相对较少,而弱阳性反应多巴胺能神经元细胞偏多。多巴胺能神经元细胞主要分布于背侧,胞体大多无神经突,只有少量呈TH免疫阳性神经元发出短的阳性纤维投射到大脑的中央神经区,说明酪氨酸主要在多巴胺能神经元细胞内被TH所羟化,只有少量的酶被运送到近处和中远处被用于羟化反应。同时证明在环节动物日本刺沙蚕体内三种AAAHs是各自独立存在的,为tph、pah、th基因进化节点问题的分析提供了依据。4.应用兔抗DβH和兔抗PNMT多克隆抗体,通过对日本刺沙蚕Neanthes japonica大脑连续切片进行免疫组织化学染色,结果表明DβH在前脑分布细胞群较多,而中脑和后脑细胞群相对分布较少,细胞胞体大于前脑。但PNMT形成的细胞群却相对少,DβH在细胞内主要分布于细胞膜上,少量充满细胞的胞体,其在细胞内的分布与在高等生物细胞内的两种存在方式即溶解状态和膜结合状态相一致,而PNMT则主要位于细胞液中,细胞核中无分布。从DβH和PNMT这两种酶的免疫组化标记结果可知,低等无脊椎环节动物脑内也是存在去甲肾上腺素能和肾上腺素能神经元细胞的,进而在脑的不同部位发挥调节作用。5.综上可知,单胺类神经递质5-HT和儿茶酚胺(多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素)在环节动物日本刺沙蚕体内各自独立存在,其在体内的生成与三种AAAHs的存在是密切相关的。