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基因组编辑技术(genome editing)是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术,是研究基因功能最重要的方法之一。对于机体内部的基因编辑需要转运载体,由于非病毒载体的转染效率比较低,因此急需找到一种高效且安全的病毒转运载体。AAV载体被视为最有发展潜力的病毒载体,具有不整合到宿主基因组、免疫原性较低、无致病性等优点,但是其承载量较小(约4.7 kb)。CRISPR-Cas9技术作为一种操作简单、灵活性好、切割效率高的基因编辑技术,可用于基因治疗。最初发现的SpCas9片段较大(约4.2 kb),后来发现了约3.2 kb的SaCas9,使AAV介导CRISPR-Cas9系统发挥作用成为可能。MSTN是一种能够负调控肌肉生长的调控因子,该基因的功能缺失会引起肉用动物的双肌表型,从而提高产肉率。目前对MSTN潜在功能及其调控机制还了解较少,为了进一步研究MSTN的作用机制,本研究进行了以下试验:1、本试验首先设计3个靶向MSTN基因的sgRNA,构建pX601-SaCas9-sgRNA重组载体。利用小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)和人肾上皮细胞系(HEK293),以T7 EI酶切法和测序法检测基因编辑效率,同时以Western blot鉴定MSTN蛋白的敲除效率。2、将 pX601-SaCas9-sgRNA与病毒辅助质粒 pAAV9-RC、pAAV9-helper 进行 AAV 病毒的包装,分离纯化重组AAV病毒并以QPCR法检测病毒滴度。3、将重组AAV病毒感染NIH3T3细胞,5 d后,以T7 EI酶切法和测序法检测基因编辑效率,同时以Western blot鉴定MSTN蛋白的敲除效率。4、重组AAV病毒感染Balb-c小鼠,6周后取腿部骨骼肌,以石蜡切片结合HE染色法观察肌纤维形态变化,并提取基因组DNA,以T7 EI酶切法和测序法检测基因编辑效率,同时以Western blot鉴定MSTN蛋白的敲除效率。结果表明:1、成功构建了靶向MSTN基因外显子的3个重组载体pX601-SaCas9-sgRNA1,pX601-SaCas9-sgRNA2,pX601-SaCas9-sgRNA3,证明其在细胞水平均能够对MSTN进行基因编辑,进而造成MSTN蛋白表达量下降。2、成功包装出 3 种重组AAV 病毒 AAV-SaCas9-sgRNA1,AAV-SaCas9-sgRNA2,AAV-SaCas9-sgRNA3,经测定滴度均大于 1010 vg/mL。3、包装出的3种重组AAV病毒在细胞上具有MSTN基因编辑能力,并能降低MSTN蛋白表达量。4、重组 AAV 病毐 AAV-SaCas9-sgRNA2,AAV-SaCas9-sgRNA3 成功感染小鼠,并对小鼠腿部肌肉的MSTN基因进行了编辑,降低了 MSTN蛋白的表达量,造成肌肉性状发生明显变化。