目的：构建pAAV-EGFP及pAAV-BDNF重组腺相关病毒,测定其感染滴度，观察AAV-BDNF对链脲佐菌素(STZ)造模大鼠视网膜神经节细胞数量影响,通过检测大鼠存活的荧光金(Fluorogold,FG)染料逆标的RGCs进行数量统计以及检测视觉诱发电位及视网膜电图来评价表达BDNF的重组AAV载体介导的基因治疗的神经保护效果。　　 方法：⑴pAAV-EGFP构建:从pCAGGS中克隆CBA promoter,并与pSEWB同时用Apa和EcoRl进行酶切消化,随后进行胶回收纯化以及连接转化,获得pCBA—EGFP-WPRE。使用限制性内切酶酶切和PCR方法检测构建质粒的准确性.使用磷酸钙转染方法检测质粒的基因表达活性。⑵.pAAV-BDNF构建:从大鼠脑中抽提总RNA,使用RT-PCR方法克隆融合有His-tag的大鼠BDNF基因,并将pCBA-EGFP-WPRE同时用Hindlll和EcoRl进行酶切消化,随后胶回收纯化及连接转化,进而获得pCBA-BDNF-WPRE。使用限制性内切酶酶切和PCR方法检测构建质粒的准确性。使用磷酸钙转染方法检测质柱的基因表达活性.Western-blotting分析视网膜中转染病毒获取的蛋白含量。⑶建立糖尿病大鼠模型,玻璃体腔注射EGFP或BDNF/His-tag融合蛋白的重组AAV病毒载体.不同时间点观察存活的荧光金(Fluorogold,FG)染料逆标的RGCs数量,并进行视同膜电图及视觉诱发电位检测。⑷BDNF受体TrkB阻断实验检测未被转染AAV-BDNF而存活的RGC数量,并进行视网膜电图及视觉诱发电位检测。　　 结果：①成功构建了pAAV-EGFH-WPRE及pAAV-BDNF-WPRE重组质粒。包装制备了腺相关病毒(rAAV-EGFP及rAAV-BDNF),经纯化、浓缩后病毒滴度为3.0×109/ml。rAAN-EGFP注射大鼠玻璃体腔3周后,视网膜冰冻切片,荧光显微镜下可观察到荧光袁达,Wrestern-blotting分析显示视网膜组织高表达EGFP及BDNF蛋白。②应用袁达BDNF的重组AAV病毒载体进行基因治疗3个月、6个月、9个月之后,分别进行了总视网膜、中心视网膜、周边视网膜RGC存活数量的统计.治疗组和对照组FG逆标的RGC数量都明显少于正常视网膜(P<0.05).但在各时间点,AAV-BDNF治疗组存活的RGC数量都明显多于MN-EGFP对照组(P<0.05),同时MN-BDNF治疗组存活的RGC数量在6个月后就不再发生明显减少(P>0.05):基因治疗3个月后发现,AAV-BDNF治疗组中被重组AAV病毒载体转染的表达BDNF的RGC数量明显多于AAV-MGFP对照组中表达EGFP的细胞数量,说明了良好的治疗效果。同时,治疗组中没有被转染的EGC数量也明显多于对照组。BDNF受体TrkB阻断实验表明,AAV-BDNF治疗组中未被转染的神经节细胞的数量发生明显下降,说明了活的细胞可能是通过吸收周围被转染的细胞所分泌的BDNF而获得保护。③视觉诱发电位检测分析,AAV-BDNF治疗组和AAV-EGFP对照组P波振幅值明显小于正常视同膜(P<0.05),同时AAV-BDNF治疗组P波振幅值明豆大于对照组(P<0.05),说明基因治疗不仅使更多的RGC被保护而存活,而且存活的RGC能够发挥其正常生理功能。视网膜电图检测分析:1个月正常对照组OPs振幅与AAV-EGFP对照组比较就有显著性差异(P<0.05),3个月正常对照组OPs振幅与AAV-EGFP对照组比较有非常显著性差异(P<0.01).且AAV-BDNF治疗组与AAV-EGFP对照组相比,OPs波振幅值明显大于AAV-EGFP对照组(P<0.05)。AAV-EGFP对照组的视网膜电图b波波幅在糖尿病6个月时与正常对照组比较有显著性差异(P<0.05),9个月正常对照组b波振幅与AAV-EGFP对照组比较有非常显著性差异(P<0.01),然而AAV-BDNF治疗组在治疗6个月及9个月时b波幅值明显大于AAV-EGFP对照组。说明基因治疗对糖尿病模型大鼠视网膜功能恢复有一定帮助。　　 结论：⑴构建的rAAV-BDNF和rAAV-EGFP能高效转染视网膜组织,并在视网膜上成功表达BDNF蛋白和绿色荧光蛋白。⑵治疗组中被重组AAV病毒载体转染的表达BDNF的RGC数量明显多于对照组中表达EGFP的细胞数量,说明了良好的治疗效果。同时也可以保护未被AAV-BDNF转染的一部分视网膜神经节细胞。⑶糖尿病大鼠模型中给予重组AAV病毒载体介导的BDNF基因治疗,对于视网膜神经节细胞数量以及功都能产生良好的治疗效果。