牛是单胎动物，繁殖力低，世代间隔长，因而新品种培育相对困难。为了提高牛的繁殖力，人工授精、胚胎移植、性别控制等技术均已应用到生产实际当中。然而，由于奶牛情期受胎率较低、超数排卵个体对激素反应差异性较大、胚胎移植妊娠率较低、流式细胞仪设备昂贵和分离速度慢而造成的性控精液高成本等原因，严重影响这些技术的推广应用和养牛生产经济效益。因此，本研究一方面从牛基因多态性着手，分析基因多态性与超数排卵效果、胚胎移植妊娠率以及精液品质的关系，鉴定繁殖性状主效基因；另一方面，从制备性别特异性抗血清着手，建立一种分离X、Y精子的新方法，从而为提高现有繁育技术水平以及繁育新技术的开发奠定基础。　　1、牛繁殖性状主效基因鉴定　　利用候选基因法，采用PCR-SSCP、PCR-RFLP和测序等技术，首先研究了候选基因GnRHR、FSHR、LHR、PGR、INHA和 INHβA在中国荷斯坦奶牛群体共计171个样本中的多态性及其与超数排卵性状的关系；其次，分析了PGR、FSHR和ESRα基因在鲁西黄牛群体共计132个样本中的多态性及其与胚胎移植妊娠率的关系，同时比较了各基因型鲁西黄牛胚胎移植时血清中孕酮和雌二醇的变化差异；最后，研究了GnRHR基因多态性对荷斯坦种公牛精液品质的影响，从而鉴定影响牛超数排卵效果、胚胎移植妊娠率以及精液品质的主效基因，发现：　　（1）GnRHR基因外显子1发生G286A和T340C突变，两位点在中国荷斯坦奶牛和荷斯坦种公牛群体中突变纯合基因型AA和CC均缺失；在位点G286A，GA基因型个体超数排卵排卵数和可用胚胎数显著大于GG基因型个体，且所有无超数排卵反应牛都属于GG基因型；此外，G286A位点对荷斯坦种公牛精液品质有显著影响。表明，GnRHR是影响荷斯坦牛繁殖性状的主效基因；　　（2）中国荷斯坦奶牛FSHR基因5′端发生G-278A突变，引起BsmFI酶切多态性，同时FSHR基因5′端存在TaqI酶切多态位点，均产生三种基因型；在G-278A位点，CC基因型个体超数排卵排卵数和可用胚胎数最高，极显著大于CD和DD基因型个体，且所有无超数排卵反应牛都属于CD和DD基因型；在鲁西黄牛FSHR基因5′端检测到G-278A突变，不同FSHR基因型鲁西黄牛胚胎移植妊娠率差异不明显。表明，FSHR是影响中国荷斯坦奶牛超数排卵效果的主效基因，是否对鲁西黄牛胚胎移植妊娠有影响有待进一步验证；　　（3）中国荷斯坦奶牛LHR基因内含子9发生G51656T、A51703G、A51726G和G51737A4个突变，分别引起HinfI、BfaI、Tsp45I和Tsp45I酶切多态性，均产生三种基因型；4个位点与超数排卵排卵数均呈显著相关，且位点A51703G和A51726G对超数排卵可用胚胎数有显著影响。表明，LHR基因是影响中国荷斯坦奶牛超数排卵效果的主效基因；　　（4）中国荷斯坦奶牛PGR基因发现AdeI-RFLP和Eco321-RFLP多态性，分别由G59752C和T81637C突变引起，酶切后均产生三种基因型；G59752C和T81637C位点均与超数排卵排卵数呈显著相关，且T81637C位点对超数排卵可用胚胎数有显著影响。在鲁西黄牛中检测到G59752C突变，GG和GC基因型群体胚胎移植妊娠率明显高于CC基因型群体，同时GG和GC基因型个体在孕酮水平上也明显高于CC基因型个体。表明，PGR基因不仅是影响中国荷斯坦奶牛超数排卵效果的主效基因，同时也是影响鲁西黄牛胚胎移植妊娠率的主效基因；　　（5）中国荷斯坦奶牛INHA基因发现MspI-RFLP多态性，由A192G突变引起，酶切后出现三种基因型；GG基因型个体超数排卵排卵数和可用胚胎数均显著大于AA和AG基因型个体，但同时GG基因型个体在未受精卵数上也显著大于AA和AG基因型。表明，INHA基因是影响中国荷斯坦奶牛超数排卵效果的主效基因；　　（6）中国荷斯坦奶牛INHβA基因发现StyI-RFLP多态性，由C7638T突变引起，酶切后出现三种基因型，不同基因型对超数排卵效果影响不显著。初步表明，INHβA基因突变对中国荷斯坦奶牛超数排卵性状无显著影响；　　（7）鲁西黄牛ESRα基因内含子4发生G75935C突变，测序发现三种基因型；GC和CC基因型群体胚胎移植妊娠率明显高于GG型群体，同时GC和CC基因型个体在孕酮水平也明显高于GG基因型个体。表明，ESRα基因是影响鲁西黄牛胚胎移植妊娠率的主效基因。　　2、精子分离新方法建立与性别特异蛋白的鉴定　　本研究利用一系列的免疫学技术制备性别特异性抗血清，建立一种分离X、Y精子的新方法；在此基础上，利用双向电泳技术和质谱技术鉴定性别特异性蛋白，发现：　　（1）经细胞ELISA检测，80倍稀释的200μL抗X精子兔血清中非特异抗体能被2×107个Y精子完全免疫中和；　　（2）经流式细胞仪检测，免疫中和后抗X精子兔血清在X精子与Y精子中的标记率分别为15.2%和7.6%，初步表明抗X精子兔血清中性别特异性抗体的存在；　　（3）利用显微受精和早期胚胎性别鉴定技术对经免疫磁珠分选法得到的理论X精子进行纯度验证，发现理论X精子中X精子实际比例达74.3%，进一步表明抗X精子兔血清中性别特异性抗体的存在，此法可作为一种分离X、Y精子的新方法；　　（4）利用免疫中和的抗X精子兔血清免疫沉淀常规精子膜蛋白中X精子的特异蛋白，经双向电泳分离发现经免疫沉淀得到蛋白的电泳图中存在很明显的3个30kDa左右的蛋白差异点，表明中和后抗X精子血清对常规精子膜蛋白中的某些蛋白有特异性的吸附作用，初步验证了X精子中特异蛋白的存在；　　（5）对蛋白差异点进行质谱分析，检索到10个候选蛋白，为后续精子性别特异蛋白的寻找奠定了基础。