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毛竹(Phyllostachys edulis)是我国分布最为广泛、栽培历史最为悠久的笋材两用竹种,占全国竹林面积的74%以上,具有重要的经济、文化、社会价值。自然条件下,毛竹通过强大的竹鞭系统来进行地下鞭延伸为主的无性克隆繁殖,在长期的生产栽培中,该繁殖方式也被人类逐渐强化。与传统的无性繁殖方式相比,采用毛竹种子育苗进行实生苗造林具有成本低、成活率高、种苗易于管理、林分抗逆性强等优势。但毛竹自然条件下结实率低,实生苗分化严重,阻碍了有性繁殖方式的应用。尽管前人开展了一些工作,但调控结实率机制尚不明确。花药是植物最重要的生殖器官之一,对植物育性具有决定性作用,开展毛竹花药育性研究能够为提高毛竹育种奠定重要基础。本文通过分析毛竹主要生殖器官的miRNA差异表达模式,筛选与毛竹育性相关的重要miRNA,对R2R3MYB基因家族的生物信息学、表达模式等进行详细分析,筛选miR159的两个重要GAMYBs靶基因。实验表明miR159及其靶基因在花药和花粉发育中起调控作用。主要研究结果如下:1.毛竹生殖器官相关miRNA挖掘及其靶基因初步鉴定选择毛竹叶片(营养器官)、雄蕊、雌蕊和幼胚(生殖器官)进行miRNA深度测序。共鉴定了96条已知miRNAs和152条新miRNAs,同时预测了332个靶基因,包括已知miRNAs对应靶基因243条,新miRNAs对应靶基因113条。一些高度保守的miRNA家族,例如mi R156、miR159等至少参与了两个以上生殖器官的发育进程。在雄蕊中,富集程度最高的包括DNA模板转录调控和细胞特化过程相关靶基因,而参与最多的通路为植物病原菌互作通路。因此,在毛竹花药发育过程中可能经常发生以病原菌为主的胁迫响应。基于本课题组的降解组测序数据,对差异表达已知mi RNA对应靶基因进行优化分析,鉴定了miR159等在内的主要miRNA对应靶标。对筛选的差异表达已知miRNA及其靶基因进行荧光定量PCR(qRT-PCR)分析,结果表明,靶基因可被其对应miRNA负调控,从而参与植物发育进程。2.毛竹miR159对花药发育调控作用研究选择并克隆两条包含毛竹miR159(PhemiR159)成熟序列的前体基因,将它们分别连接超表达载体异源转入拟南芥mir159ab双突变体,成功恢复了突变体的表型。因此,毛竹miR159前体基因可以在拟南芥中被正确加工为miR159成熟序列来发挥调控作用。表型分析结合q RT-PCR结果显示,AtMYB33是PhemiR159主要的拟南芥内源靶基因,对突变体表型恢复有决定性作用。Phe-PremiR159在野生型拟南芥中超表达后,会引起部分高表达的转基因株系败育。体视解剖和电子扫描结果表明,Phe-PremiR159会导致高表达转基因拟南芥花药无法正常开裂、成熟花粉无法散出而降低育性。半薄切片结果说明,Phe-PremiR159超表达株系的花药内皮层缺乏次生加厚、裂口区缺少机械外力而无法开裂。根据qRT-PCR结果,与花药开裂相关的MYB26、NST1、NST2等基因的表达量在超表达株系中均发生显著变化。因此,Phe-PremiR159可能通过负调控AtMYB33来调节这些次生增厚相关基因的表达,从而影响超表达拟南芥株系的花药开裂。3.毛竹R2R3MYB基因家族和表达模式分析筛选114条毛竹R2R3MYB基因进行初步分析,包括构建系统进化树、基因结构和基因进化分析等。同时根据在毛竹4个花发育阶段和雄蕊、雌蕊、颖片、稃片中的表达模式,鉴定了在毛竹花发育和生殖器官中可能存在重要调控作用的R2R3MYB基因。Gao等(2014)指出,MYB转录因子在毛竹花发育过程可能参与了赤霉素调控途径。因此,赤霉素诱导的GAST家族被选择并进行了转录组数据分析。根据表达模式构建共表达网络。结果表明,4条PheGAST枢纽基因共与44条PheR2R3MYB基因呈显著正相关(PPC>0.85),其中包括毛竹miR159的靶基因之一PheMYB2R-98。初步推测PheR2R3MYBs可以通过与PheGASTs相互协调的形式参与毛竹花器官发育过程,该结论也将赤霉素途径和毛竹有性繁殖进程有机结合起来。4.毛竹GAMYB基因对花药发育的调控作用毛竹包含两个受miR159靶切的GAMYB基因(PheMYB2R-42和PheMYB2R-98),它们在雄蕊中差异表达显著,可能参与毛竹花药发育。PheMYB2R-42和PheMYB2R-98具有保守的GAMYB结构特征,并且定位在细胞核内。然而与PheMYB2R-42不同的是,PheMYB2R-98不具有转录激活活性。PheMYB2R-42和PheMYB2R-98超表达后均会导致转基因拟南芥花粉畸形、花粉活力减弱、花粉管萌发率降低等相同表型。重点对PheMYB2R-42转基因株系进行qRT-PCR分析,结果表明,PheMYB2R-42超表达后可以下调拟南芥中绒毡层PCD和孢粉素合成等关键基因的表达量,并抑制上游绒毡层早期发育相关基因的表达,从而影响转基因拟南芥花粉发育、降低雄配子的育性。由于缺少转化体系,Phemir159-GAMYB途径在毛竹花药中的调控作用无法得到验证。根据同源比对和酵母单杂交实验,初步筛选出了在毛竹中PheMYB2R-42的潜在下游靶基因PheGPAT3,推测PheMYB2R-42在miR159的负调控下,可能通过调控PheGPAT3来间接调节其他毛竹花药发育基因的表达。综上所述,本文鉴定了毛竹生殖器官中已知和新的miRNAs,挖掘了与毛竹育性相关的“miRNA-靶基因”调控路径;从毛竹R2R3MYB基因家族中筛选了miR159的靶基因GAMYBs;初步验证了毛竹“mi R159-GAMYB”路径在花药和花粉发育中的功能。本研究将为毛竹花药发育和有性生殖分子调控机制研究提供实验依据,为毛竹遗传育种和种质资源研究奠定一定基础。