论文部分内容阅读
目的肝脏是一个天然免疫占优势的免疫器官,其中包括NKT细胞、NK细胞、表达γδTCR 链的γδT 细胞和粘膜相关invariant T(mucosal-associated invariant T,MAIT)细胞。肝脏γδT细胞比例明显高于脾脏、淋巴结和外周血。许多研究表明,γδT细胞存在胸腺外发育途径,小肠是其发育场所之一,我们实验室的前期研究也初步证实肝脏有可能是γδT细胞胸腺外发育的场所,那么γδT细胞在肝脏内是如何发育分化的,与其在胸腺中的发育分化有何不同,尚不清楚。在小鼠个体发育过程中,胚胎肝脏是造血干细胞(HSCs)增殖和分化的主要场所,其含有大量的造血干细胞和造血前体细胞。出生后,造血位点转移至骨髓,但是有多个研究显示,小鼠成年后肝脏中依然残留有少量造血干细胞并且具有自我更新和长期造血造血重建功能。近年来有研究发现成年肝脏中存在一群特有的造血干细胞Lineage-Mac-1+Sca-1+(LMS)细胞。通过移植转输实验发现,其来源于胚胎肝脏造血并且能在肝内发育形成肝脏驻留NK细胞(LrNKs)。那肝脏特有LMS细胞能否在肝脏中发育分化成γδT细胞?肝脏γδT细胞是否存在独特的肝内发育过程?这些问题尚无确切研究。为了探讨上述问题,本课题从以下几个方面对肝脏γδT细胞肝内发育过程进行了初步探究。首先,我们通过检测肝脏、脾脏、胸腺以及小肠上皮内淋巴细胞(IELs)中γδT前体细胞的比例和表型发现肝脏γδT前体细胞比例相对较高,且具有独特的表型特征。其次,通过体内过继转输实验和体外共培养实验从体内体外验证了肝脏γδT细胞前体细胞具有发育分化为成熟γδT细胞的能力。最后,我们通过过继转输胚胎期、新生期和成年期等不同时期肝脏特有造血干细胞LMS细胞,发现其均可以在肝脏中重建出γδT细胞,重建的γδT细胞具有独特的转录因子表达和Vγ亚型,分泌的细胞因子以IFN-γ为主。初步揭示了肝脏γδT细胞独特的肝内发育过程。方法1.分离成年小鼠肝脏、胸腺、脾脏和小肠单个核细胞,流式细胞术检测其中γδT细胞和CD24+CD73+γδT细胞前体细胞的比例及其表型。2.分选成年小鼠肝脏和胸腺γδT前体细胞与OP9-DL1共培养,体外观察肝脏或胸腺来源的γδT前体细胞向成熟γδT细胞发育分化的能力。3.分选CD45.1来源的成年小鼠肝脏和胸腺γδT前体细胞过继转输至半致死量照射(5Gy)的TCRδ-δ+鼠中,体内观察肝脏或胸腺来源的γδT前体细胞向成熟γδT细胞发育分化的能力。4.流式细胞术检测E16.5天小鼠、新生小鼠以及成年小鼠肝脏和胸腺组织中Lin-Mac-1+Sca-1+的表达情况。5.分选CD45.1背景的E16.5天、新生时期以及成年时期等不同时期肝脏和胸腺Lineage-(Lin-)细胞或LMS细胞过继转输至半致死量照射(5Gy)的TCRδ-δ-鼠中,体内观察其向γδT细胞发育的情况、细胞因子分泌的情况以及转录因子表达和Vγ亚型的情况。结果1.成年小鼠肝脏γδT细胞和CD24+CD73+γδT细胞前体细胞比例显著高于胸腺和脾脏。并且肝脏γδT细胞前体细胞表型特点是高表达CD44、低表达CD27;而脾脏和胸腺的CD24+CD73+yδT细胞前体细胞高表达CD27,CD44的表达为中低水平。2.成年小鼠肝脏CD24+CD73-γδT细胞前祖细胞和CD24+CD73++γδT细胞前体细胞通过与OP9-DL1细胞共培养可以分化为成熟的γδT细胞且具有分泌细胞因子的能力。肝脏成熟γδT细胞分泌IL-17水平高于IFN-y,胸腺成熟γδT细胞分泌的细胞因子以IFN-γ为主。3.成年小鼠肝脏CD24+CD73+γδT细胞前体细胞过继转输至TCRδ-/-鼠中,可以发育分化为成熟的yδT细胞。4.胚胎肝脏来源的单个核细胞能在各个组织中重建出γδT细胞,并且重建的γδT细胞优势分泌细胞因子IFN-γ;胸腺来源的单个核细胞重建的yδT细胞优势分泌细胞因子IL-17A。5.体内转输实验结果表明,新生期和成年期小鼠肝脏来源的Lineage-细胞均可以在肝脏中重建出γδT细胞,并且在各组织中重建的γδT细胞几乎全部为分泌IFN-y的γδT1细胞。6.胚胎期、新生期和成年期小鼠肝脏中均有LMS细胞,并且随年龄的增长比例逐渐降低,而胸腺在发育的各个阶段均不存在LMS细胞。7.体内转输实验结果表明,胚胎期、新生期和成年期小鼠肝脏来源的LMS细胞均可以在肝脏中重建出γδT细胞,并且在各组织中重建的γδT细胞几乎全部为分泌IFN-γ的γδT1细胞,表达转录因子T-bet且主要是Vγ1+γδT细胞。结论1.相比于胸腺、脾脏和小肠,肝脏含有较高比例的γδT细胞前体细胞,且这些前体细胞具有独特的表型和功能特点。2.体外和体内实验验证了成年小鼠肝脏CD24+CD73-δT细胞前祖细胞和CD24+CD73+γδT细胞前体细胞均可以发育分化为成熟的γδT细胞。3.不同时期肝脏特有LMS细胞均可以在肝脏中重建出γδT细胞。重建的γδT细胞主要是Vγ1+γδT细胞,分泌的细胞因子主要是IFN-y,并且T-bet的表达高于RORγt。肝脏γ5T细胞存在独特的肝内发育过程。