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背景与目的肿瘤抑素(tumstatin)是一种由胶原Ⅳ分子α3链的中间三股螺旋区域共244个氨基酸组成的具有抑制血管生成和抗肿瘤细胞增殖作用的蛋白质,其活性区域位于N端的74-98氨基酸功能肽(抗血管生成作用)和197-215氨基酸功能肽(抗肿瘤作用)。但完整的tumstatin蛋白立体结构中,197-215氨基酸功能肽被其他肽段遮盖而不能发挥直接的抗肿瘤作用。因此本课题组在前期研究中,将来源于tumstatin N端74-98氨基酸功能肽通过人IgG3上游铰链区序列与Tumstatin N端197-215氨基酸功能肽连接获得了一种融合肽,命名为重组血管基膜衍生多功能肽(Recombinant Vascular Basement-derived Multifunctional Peptide, rVBMDMP),并初步证实其具有抑制人脐静脉内皮细胞和结肠癌细胞的双重作用。本研究将在此基础上进一步系统观察rVBMDMP抑制肺癌细胞生长作用和可能机制,为开发这一新型抗肿瘤蛋白药物提供理论依据。方法(1)MTS法检测rVBMDMP对体外培养人肺腺癌(A549)细胞系,大细胞肺癌(H460)细胞系,小细胞肺癌(H446)细胞系、肺鳞状细胞癌(H520)和人胚肺二倍体细胞(KMB-17)细胞系增殖活性的影响以及对化疗药物顺铂(DDP)抗肺癌细胞的增敏作用；平皿克隆法测定rVBMDMP对A549细胞克隆形成率的影响；DNA琼脂糖凝胶电泳、AO/EB双染及Hoechst染色等方法观察rVBMDMP对A549细胞凋亡的影响；划痕法及transwell小室法测定rVBMDMP对A549细胞体外迁移及侵袭转移能力的影响；(2)采用功能分类基因芯片—癌通路发现者芯片检测rVBMDMP作用肺癌细胞后凋亡与侵袭转移相关基因的改变；并应用real-time PCR和western bloting技术验证芯片结果；(3)应用免疫共沉淀技术检测rVBMDMP与整合素(integrin)αVβ3的相互作用；Western blotting检测rVBMDMP作用A549细胞后FAK/PI3K信号通路和Fas/caspase-8信号通路相关分子表达情况；免疫组织化学检测rVBMDMP作用后裸鼠移植瘤内FAK/PI3K信号通路和Fas/caspase-8信号通路相关分子表达情况；TUNEL法检测rVBMDMP作用后裸鼠移植瘤细胞凋亡情况；Western blotting检测rVBMDMP作用A549/DDP细胞后磷酸化PI3K/Akt,耐药相关蛋白MRP,抗凋亡蛋白bcl-2和caspase-3的表达情况。结果(1) rVBMDMP能不同程度选择性抑制肺癌细胞的增殖活性,其中对A549的抑制作用最强；(2) rVBMDMP促进A549细胞发生时间依赖型DNA非随机性剪切和剂量依赖型凋亡形态学改变；显著抑制A549细胞体外迁移和侵袭能力；(3)当与DDP合用时,10.0μM的rVBMDMP使DDP对A549细胞的IC50由4.614μg/mL下降为1.320μg/mL (P<0.05),对A549/DDP细胞(DDP耐受细胞)的IC50由31.19μg/mL下降为11.82μg／mL(P<0.05)；(4)10.0μMrVBMDMP作用后,A549细胞中p27基因(CDKN1B),粒酶A(GZMA),转移抑制基因KISS-1,信号转导和转录因子(RAF1,RASA1,SRC),细胞周期蛋白D1(CCND1)、整合素受体IntegrinαⅤ、α1、α2、α6等16个基因表达上调,信号转导和转录因子(CTNNB1, JUN, MYC, MAP2K1),凋亡蛋白酶激活因子(APAF1),调控血管发生的基因(FGF2,IGF1,THBS1),侵袭和转移相关基因(SERPINB2, SERPINE1, SERPINB5, uPA, uPAR)等21个基因表达下调；其中CDC25A、uPA、uPAR、IntegrinαⅤ、KISS1等基因的验证结果与芯片结果一致；(5) rVBMDMP能与A549细胞中integrinαⅤ/β3相互结合,抑制integrinαⅤβ3和下游的FAK、PI3K和Akt等蛋白的磷酸化,rVBMDMP干预后的裸鼠移植瘤内的免疫组化验证结果与细胞检测结果一致；(6) rVBMDMP作用早期(12h)能致A549细胞Fas表达上调,caspase-8活化；24h后,能使bcl-2、MRP表达下调caspase-3活化,rVBMDMP处理的裸鼠移植瘤免疫组化和TUNEL检测结果与细胞结果一致。结论(1) rVBMDMP能显著抑制人肺腺癌A549细胞体外生长增殖和侵袭转移能力,诱导其凋亡；(2)建立了rVBMDMP作用A549细胞的差异基因表达谱,共获得37个差异表达基因；(3) rVBMDMP抑制A549细胞生长、诱导其凋亡作用可能与其结合integrin aVβ3,抑制integrin aVβ3/FAK/PI3K/Akt的蛋白磷酸化有关；(4) rVBMDMP诱导凋亡作用可能与上调Fas表达、抑制bcl-2表达有关；(5) rVBMDMP可能通过上调KISS-1的表达,下调uPA和uPAR的表达来抑制人肺癌细胞的侵袭和转移；(6) rVBMDMP能增加A549和A549/DDP细胞对DDP的敏感性,其作用可能与上述机制及抑制MRP表达有关。