肝细胞癌是一种严重危害人类健康的疾病,化疗在预防术后肿瘤复发和转移中发挥着不可替代的作用,但肝癌的化疗效果不佳,原因是多方面的,其中一个主要原因与多药耐药现象有关。多药耐药现象一直是限制肿瘤化疗成功的主要原因,引起肿瘤多药耐药的机制非常复杂,目前认为可能存在的耐药机制有药理学机制和细胞机制,其中ABC转运蛋白所介导的肿瘤多药耐药备受关注。ABC转运蛋白全称为ATP结合盒膜转运蛋白(ATP Binding CassetteTransporters),它们能够介导多种底物分子在细胞内外的运输。研究发现,ABC转运蛋白的泵功能与肿瘤细胞内药物聚集的降低有关,是肿瘤细胞产生多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的主要原因。成为肿瘤细胞免受化疗药物攻击的重要防御机制。根据序列同源性及跨膜域拓扑结构的不同,ABC转运蛋白分为七个亚家族(ABCA－G),目前为止,在人类已经发现ABC家族有48个成员,与药物转运相关的蛋白主要集中于ABCA、ABCB、ABCC和ABCG这几个亚家族中。肿瘤多药耐药是肿瘤化疗失败的最常见原因,是人类治疗肿瘤的一大障碍。肿瘤细胞或者在治疗的初始阶段就对多种抗肿瘤药物无明显反应(内在性耐药);或者是在经过几个疗程后,肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生了耐药性(获得性耐药)。当前,在肝癌的治疗中,肿瘤耐药的现象被认为是肝癌化疗效果无法进一步提高的主要原因之一,研究表明与ABC转运蛋白有关。目前国内关于肝癌耐药基因的检测几乎都是检测病理标本中的ABC转运蛋白,而且文献报导多是有关ABCB1、ABCC1和ABCG2基因编码的多药耐药蛋白MDR1(P-gp)、多药耐药相关蛋白MRP1、乳腺癌耐药蛋白BCRP的文章。最近的研究发现,ABCC亚家族至少包含有九个成员(MRP1-9),其中ABCC2、ABCC3、ABCC5可能也参与了肿瘤的耐药,但它们在肝癌中的表达是否与肝癌的耐药有关,目前国内还鲜见有相关的报道。由于肿瘤细胞内化疗药物的耐受性是与细胞内耐药基因的表达强度相关的,因此检测耐药基因在药物诱导前后表达强度的变化就可以发现可能参与耐药的有关基因。肿瘤耐药的产生往往涉及多个耐药基因的表达,是多个基因参与的结果,自从MDR1基因发现以来,新的耐药相关基因不断被发现,显然检测多个基因的表达能更好的判断预后,比仅仅检测单个基因的更有意义。为了解多药耐药相关蛋白成员与肝癌耐药的相关性,进一步探讨肝癌细胞的耐药机制,我们检测了肝癌细胞中编码多药耐药相关蛋白(MRP)的ABCC亚家族中ABCC2 mRNA、ABCC3 mRNA、ABCC5 mRNA的表达,研究其表达是否与肝癌的耐药有关,并进一步为肝癌化疗的药物研发提供新的靶点。目前常用的几种检测目的基因表达的方法有:形态学方法,荧光原位杂交(FISH),流式细胞仪等,均存在着检出率较低的弊端,聚合酶链反应(PCR)技术可以从10~5-10~6正常细胞中检测出一个目的细胞,是公认的比较敏感的检测方法,但传统PCR技术只能做到定性或半定量检查,不能精确定量。一种理想的检测方法应具备如下条件:特异性强,敏感度高,重复性好,快速简便,定量分析。荧光定量聚合酶链反应技术(Real-timefluorescent quantitative PCR.)的出现为解决这一难题提供了新的思路。采用SYBR GreenⅠQRT-PCR(quantitatie realtime PCR)技术对靶基因进行实时荧光定量分析是近年来发展起来的一项新技术。SYBRGreenⅠ是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。因此,它的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号强度检测出PCR体系中存在的双链DNA数量,从而对靶基因进行定量分析,其准确性和灵敏性都比普通RT-PCR高。本课题采用SYBR GreenⅠQRT-PCR方法检测ABCC亚家族中ABCC2 mRNA、ABCC3 mRNA、ABCC5 mRNA的表达,探讨ABCC2、ABCC3、ABCC5基因的表达与肝癌耐药的关系。目的1.建立荧光定量RT-PCR检测目的基因表达水平的方法;2利用SYBR Green荧光定量PCR方法,在mRNA水平上检测多药耐药相关蛋白ABCC2、ABCC3、ABCC5在肝脏正常细胞、肝癌细胞、肝癌耐药细胞中的表达,并比较他们在三种细胞中表达的差异性,以期进一步阐明肝癌细胞的耐药机制是否与ABCC2、ABCC3、ABCC5的表达有关。材料和方法1.根据基因序列设计合成引物,培养肝脏正常细胞,肝癌细胞,肝癌耐药细胞,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA。2.纯化管家基因beta-actin的PCR产物,经T4连接酶连接入pGEM-Teasy载体,转化到宿主大肠杆菌DH-5α中,克隆出阳性定量标准模板,将阳性标准模板按10倍梯度稀释,在PE7700型PCR仪上进行扩增,根据标准品绘制标准曲线,建立起荧光定量RT-PCR检测基因表达水平的方法。取肝脏正常细胞,肝癌细胞,肝癌耐药细胞的cDNA,利用标准曲线进行目的基因ABCC2 mRNA、ABCC3 mRNA、ABCC5 mRNA的检测,由软件自动计算出待测样品的准确含量,最后对该方法的灵敏度,特异性,重复性和稳定性进行评价。结果1、提取的细胞总RNA质量完好,常规RT-PCR可扩增出特异性目的条带,将重组质粒做为阳性定量标准模板,建立了荧光定量RT-PCR检测目的基因的方法,得到一组反应核酸扩增的S型动力曲线和一条定量标准曲线,起始模板的对数值与循环域值(CT)值之间有良好的相关关系(r=0.991.P＜0.01).2、正常肝细胞组,肝癌细胞组,肝癌耐药细胞组中ABCC2 mRNA、ABCC3mRNA、ABCC5 mRNA检测结果如下(单位copies/ul RNA):(1)ABCC2 mRNA在正常肝脏细胞组,肝癌细胞组,肝癌耐药细胞组的平均表达水平分别为:7858±656、8908±681、43920±4630;其在正常肝细胞组与肝癌细胞组间的表达没有显著性差异(P=0.397),而他们与肝癌耐药细胞组间的表达均有显著性差异(P=0.000)(2)ABCC3 mRNA在正常肝脏细胞组,肝癌细胞组,肝癌耐药细胞组的平均表达水平分别为:3767±320、6558±616、86110±4227;其在正常肝细胞组与肝癌细胞组间的表达具有显著性差异(P=0.018),而他们与肝癌耐药细胞组间的表达亦均有显著性差异(P=0.000)(3)ABCC5 mRNA在正常肝脏细胞组,肝癌细胞组,肝癌耐药细胞组的平均表达水平分别为:13810±896、35060±1959、66370±1496;其在正常肝细胞组,肝癌细胞组,肝癌耐药细胞组三组间的表达均有显著性差异(P=0.000)结论1.ABCC2、ABCC3、ABCC5在三种细胞中均有表达,ABCC2基因在BEL/ADM细胞中的表达量明显高于在L-02、BEL细胞中的表达,而其在L-02,BEL两种细胞中的表达没有显著性差异,提示ABCC2可能参与了肝癌的内在性耐药;ABCC3、ABCC5基因表达量在L-02、BEL、BEL/ADM三种细胞中均有显著性差异,提示ABCC3、ABCC5可能与肝癌的获得性耐药有关。2.通过构建标准质粒,将重组质粒作为阳性定量标准模板,根据标准品绘制标准曲线,成功地建立了荧光定量RT-PCR检测目的基因表达水平的方法。3.荧光定量RT-PCR方法具有敏感性高,特异性强,重复性和稳定性好等优点,是进行目的基因检测的一种快速简便,定量准确的方法。