研究背景:鼻咽癌是起源于鼻咽上皮组织的恶性肿瘤,其有着独特的地理分布和复杂的病因学。鼻咽癌的发生与不同地区、种族分布显著相关。鼻咽癌的发病率在全球低于1/100,000(人/年),然而在我国南部和东南亚地区,鼻咽癌发病率高达20-30/100,000(人/年)。鼻咽癌的病因尚未完全明确,目前认为鼻咽癌的发生是EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)潜伏感染、遗传易感性以及环境因素等相互作用,且多步骤发展的过程。虽然目前放射治疗技术的改善极大的提高了鼻咽癌患者的5年生存率,但是肿瘤局部复发和远处转移仍是鼻咽癌患者死亡的主要原因。因此,探究鼻咽癌转移的机制并寻找新的治疗靶点迫在眉睫。能量代谢异常是肿瘤的重要特征。伴随着异常活跃的脂肪酸代谢,肿瘤细胞内的酮体代谢也可能发生变化,并影响肿瘤细胞的恶性生物学行为。我们前期研究发现鼻咽癌细胞中存在脂肪滴堆积现象,提示脂肪和脂肪酸代谢发生异常改变。为究其因,进一步通过生物信息学分析发现生酮路径的关键基因HMGCL在鼻咽癌中转录失活。因此,在本研究中我们将验证HMGCL基因在鼻咽癌中的失活及其对酮体生成的调控,探究其失活所导致的酮体含量增高对鼻咽癌增殖与转移行为的影响及其分子机制。从酮体代谢异常的角度深入诠释鼻咽癌的发病机制,也可能为鼻咽癌的治疗提供新的靶点。探索鼻咽癌中生酮通路关键基因HMGCL在鼻咽癌中转录和表达的异常及其功能后果。探究HMGCL基因在鼻咽癌中对酮体生成的调控以及内、外源性酮体对鼻咽癌细胞增殖和转移的影响,进一步揭示其分子机制。研究方法:1.在NCBI下属的基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中提取鼻咽癌组织基因表达芯片的数据,筛选出鼻咽癌中酮体代谢相关通路基因的转录差异基因。2.利用NCBI创建的肿瘤基因组数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA),提取11种人类恶性肿瘤的RNA测序结果进行统计,分析HMGCL基因在人类多种恶性肿瘤中的转录改变。3.利用Quantitative real-time RT-PCR、蛋白免疫印迹Western Blot法以及Immunohistochemical法检测HMGCL在鼻咽癌中的转录水平和组织分布。4.建立外源性过表达HMGCL的鼻咽癌细胞系株,通过MTT增殖实验、平板克隆形成实验、2D细胞划痕实验以及3D细胞侵袭实验评价HMGCL基因对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响,同时利用Western blot方法检测上皮间-质转化相关因子E-Cadherin,vimintin,β-cetenin的表达,评价HMGCL基因对鼻咽癌上皮间质转化的影响。5.利用外源性酮体处理鼻咽癌细胞系,通过MTT实验和划痕实验,评价外源性酮体对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响;检测内、外源性酮体对ROS氧化应激的而影响,并进一步利用ROS抑制剂NAC处理鼻咽癌细胞,评价HMGCL是否依赖激活ROS影响鼻咽癌细胞的增殖和转移。研究结果:1.生物信息学分析提示HMGCL基因在鼻咽癌组织中转录表达下调分析表达芯片结果显示,HMGCL在鼻咽癌中表达下调约4倍(P<0.05)。这提示HMGCL基因可能在鼻咽癌细胞的酮体代谢异常中起关键作用。研究目的:2.生物信息学分析提示HMGCL基因在多种肿瘤中表达下调分析TCGA数据库结果显示,HMGCL基因在结肠癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌等11种肿瘤中出现明显的表达下调;提示HMGCL基因表达下调可能是在肿瘤细胞中普遍存在的现象,与人类多种肿瘤的发生发展有一定的关系。3.发现HMGCL基因在鼻咽癌中转录失活我们通过检测HMGCL基因在鼻咽癌细胞系和永生化正常鼻咽上皮细胞系(NP69)中的表达后发现,相对正常鼻咽上皮细胞系,HMGCL在鼻咽癌细胞系中表达显著降低,进一步,我们在鼻咽癌组织和正常鼻咽部组织检测HMGCL基因的转录表达水平。实验结果显示,HMGCL基因在鼻咽癌组织中的表达水平明显低于对照组织。通过免疫组织化学染色,我们发现HMGCL蛋白主要表达在鼻咽正常上皮细胞胞浆,在鼻咽癌组织中呈现不表达或低表达状态。4.外源性表达HMGCL基因显著上调鼻咽癌细胞内源性β-羟丁酸。内、外源性β-羟丁酸的增加与细胞内ROS激活呈正相关。外源性过表达HMGCL基因后可引起鼻咽癌细胞中β-羟丁酸含量显著提高。进一步我们检测了转染HMGCL的鼻咽癌细胞及其对照组和酮体处理的鼻咽癌细胞及其对照组内ROS水平。发现转染HMGCL后,鼻咽癌细胞内ROS水平显著升高,鼻咽癌细胞酮体处理后也出现ROS水平升高的现象,内、外源性β-羟丁酸的增加与细胞内ROS激活呈正相关。5.内、外源性β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进鼻咽癌细胞发生间质-上皮转化。通过MTT细胞增殖实验、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验,发现内、外源性β-羟丁酸可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过Western blot方法检测了上皮间-质转化相关蛋白E-Cadherin,vimintin,β-cetenin的表达,显示内、外源性β-羟丁酸的产生促进鼻咽癌细胞发生间质-上皮转化。6.ROS抑制剂NAC可逆转HMGCL抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移能力。HMGCL基因能上调内源性β-羟丁酸的含量激活ROS,提示HMGCL基因的表达与调控ROS有关;且ROS抑制剂NAC能促进鼻咽癌细胞的增殖和迁移能力,提示ROS是HMGCL发挥作用的重要调节因子。研究结论:1.HMGCL在鼻咽癌中转录和表达水平下调;2.外源性表达HMGCL基因抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为;3.内、外源性酮体通过调控ROS水平抑制鼻咽癌的恶性生物学行为。综上所述,生酮路径关键基因HMGCL可能是一个鼻咽癌候选的抑癌基因。