染色体维持蛋白1（CRM1）也称为核输出蛋白1（XPO1）,在肿瘤细胞中普遍表达,主要负责将带有核输出信号的蛋白从细胞核转运到细胞质中。目前,已知CRM1转运出核的蛋白多达404个,其中大部分为抑癌蛋白。CRM1调控抑癌蛋白出核促使抑癌蛋白丧失抑癌功能,是肿瘤研究热门靶点蛋白。目前,唯一批准上市的CRM1抑制剂KPT-330,表现出的毒副作用使其临床应用受到限制,急需开发新型低毒副作用的CRM1抑制剂。莱菔素（LFS-01）是本实验室从天然产物数据库中筛选的低毒性的CRM1共价抑制剂,对三阴性乳腺癌杀伤活性为微摩尔级别,其异硫氰酸酯基团与CRM1的539位点半胱氨酸发生共价结合进而影响CRM1转运功能。为提升CRM1抑制剂活性,基于结构改造策略设计了新型CRM1抑制剂LFS-31,基于人工智能模型策略得到了 LFS-1107。本文主要工作是验证LFS-01抗三阴性乳腺癌的活性和机制,设计新型CRM1抑制剂LFS-31和机制验证,以及验证LFS-1107抗三阴性乳腺癌及抗三阴性乳腺癌干细胞的活性和机制。主要工作总结如下:1.通过分析149例临床乳腺癌患者病理切片,发现CRM1在乳腺癌中广泛表达,CRM1高表达组患者总体生存期短。通过细胞毒性测定,发现三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468比非三阴性乳腺癌细胞系MCF-7、BT-474对LFS-01敏感性高,并且药物对正常乳腺上皮细胞几乎无毒性。蛋白质印迹法检测,发现LFS-01可以抑制信号传导与转录因子3（STAT3）的激活。细胞免疫荧光技术以及蛋白质印迹法检测LFS-01可以诱导细胞发生自噬。最后,通过蛋白质印迹法和流式细胞仪检测,发现LFS-01诱导细胞发生凋亡。2.将LFS-01甲基亚磺酰基中的甲基碳原子取代为苯环,形成化合物LFS-06,对MDA-MB-231细胞的半抑制浓度为0.98微摩尔,相对于LFS-01的半抑制浓度降低了15.9倍。在LFS-06苯环的3,5位点分别随机双取代205个基团,形成42025个化合物的虚拟组合化合物库。通过类药五原则,药物的吸收、分配、代谢、排泄和毒性进行筛选,将筛选出的化合物与靶点蛋白CRM1的分子对接,最终筛选出化合物LFS-31。LFS-31对MDA-MB-231细胞半抑制浓度为144.9纳摩尔,相对于LFS-06活性提高约7倍,相对于LFS-01活性提高103倍。在细胞水平上进行机制的验证,揭示LFS-31通过阻滞CRM1货物蛋白IκBα在细胞核中,持续抑制NF-κB转录的激活,诱导细胞发生凋亡。3.LFS-1107为实验室前期基于人工智能模型设计的CRM1抑制剂。通过细胞毒性测定,发现LFS-1107对MDA-MB-231细胞半抑制浓度达到40.8纳摩尔,相对于LFS-06 活性提高 24 倍,相对于 LFS-01 活性提高了 300 倍以上。并且 LFS-1107 对 MDA-MB-231细胞抑制活性高于KPT-330。通过蛋白质印迹法,发现LFS-1107显著抑制p-STAT3的表达。通过蛋白质印迹法检测,发现CRM1货物蛋白存活蛋白（Survivin）在药物处理3小时细胞核内表达增多,随后表达量减少。通过细胞免疫共沉淀实验,发现LFS-1107处理细胞3小时后细胞核内STAT3能够和存活蛋白发生结合。通过三阴性乳腺癌类器官模型,验证了 LFS-1107对三阴性乳腺癌细胞具有较好杀伤活性,半抑制浓度140nM-1.5 μM。通过裸鼠成瘤实验的体内实验模型,验证了 LFS-1107对乳腺癌细胞增殖具有较强的抑制作用。通过流式细胞仪收集药物干预组裸鼠肿瘤组织中肿瘤干细胞,发现LFS-1107降低肿瘤干细胞数量。通过免疫组化方法检测裸鼠肿瘤组织的蛋白表达,发现LFS-1107抑制肿瘤干细胞标志物Sox-2,Oct-4,Nanog的表达。4.通过对149例食管鳞癌患者病理组织切片分析,发现STAT3和NF-κB相对于癌旁组织过度表达,并且两者蛋白共表达存在显著关联性。通过蛋白质印迹法检测,发现LFS-1107可以双重抑制食管鳞癌细胞磷酸化STAT3与NF-κB的表达。通过构建食管鳞癌肿瘤模型,体内实验验证LFS-1107可以抑制食管鳞癌细胞的增殖。综上所述,通过对实验室自主研发和设计的一系列CRM1抑制剂进行优化,显著提高药物活性,通过靶点和活性功能验证实验,揭示了 CRM1抑制剂抗乳腺癌和食管鳞癌的机制。本研究对CRM1抑制剂的研发以及临床应用提供重要参考依据。