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研究背景:替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是一种新型咪唑四嗪类烷化剂,在生理环境可以通过非酶途径快速转化为活性化合物,并通过诱导DNA甲基化来促进肿瘤细胞凋亡。TMZ吸收迅速,易于透过血脑屏障,并具有良好的抗胶质瘤活性,因此在中枢神经系统肿瘤特别是恶性胶质瘤化疗中得到了广泛的应用。然而肿瘤细胞对TMZ的耐药性经常发生,是临床上化疗失败的主要原因。因此,如何解决TMZ耐药、增加恶性胶质瘤细胞对TMZ的敏感性已成为神经外科临床医生及研究人员的最新关注热点问题。雌激素受体β是一种与神经细胞发育和分化有关的多功能蛋白,具备抑癌基因活性,其表达水平的变化与神经胶质瘤的发生发展有着密切的关系。甘草素(Liquiritigenin,Liq)是存在于豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)中的二氢黄酮单体化合物,是一种天然的雌激素受体β(estrogen receptor,ERβ)激动剂。前期试验发现Liq能抑制多种肿瘤如乳腺癌、宫颈癌的增殖,同时具备增加化疗药物的敏感性,预防肿瘤复发的功效。本课题拟从体内和体外两个方面观察Liq对TMZ抗神经胶质瘤治疗效果的影响,探讨Liq、TMZ联合使用在临床应用方面的优越性;同时深入研究Liq增加肿瘤细胞对TMZ敏感性的分子基础,为Liq在胶质瘤治疗方面的重要作用提供理论基础和实验依据。方法:研究分体内、体外两个部分。体外研究我们选用了三种人神经胶质瘤细胞株:对TMZ低敏感性的U138,对TMZ高敏感性的U251以及TMZ耐药细胞株T98G,采用MTT法、流式细胞术法检测不同浓度的Liq单独使用或者与TMZ联用在体外对胶质瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响;采用Western Blot方法检测Liq和TMZ作用后ERβ、MGMT、Caspase-3、Akt、p-AKT、P70S6K、p-P70S6K等凋亡因子和信号分子蛋白表达水平及磷酸化水平的变化;采用RNA干扰的方法沉默ERβ的表达,明确Liq对PI3K/AKT/m TOR信号通路影响的机制;联合使用PI3K/AKT/m TOR通路抑制剂和激活剂,进一步探讨Liq对该通路的调控作用以及促进TMZ敏感性的分子机制。体内研究采用裸鼠胶质瘤模型作为研究对象,在裸鼠左腹皮下接种U138胶质瘤细胞(106/100μl)后,分为四组:对照组(DMSO),TMZ组(50 mg/kg/d),Liq组(30 mg/kg/d)以及联合组(TMZ 50 mg/kg/d+Liq 30 mg/kg/d),每日进行腹腔注射,观察各组裸鼠肿瘤生长状况,于接种移植瘤的30日处死裸鼠,在体内水平研究Liq对ERβ表达的影响以及对TMZ抗肿瘤效果的协同作用。结果:一、体外实验:胶质瘤细胞U138经过不同浓度的Liq(10、20、40、80、160和320μM)处理72 h后,细胞活性测试结果显示Liq对U138有显著的抑制作用,且伴随浓度的增加其抑制作用逐渐增强,呈现剂量依赖性效应。其中80μM的Liq既可有效抑制U138细胞的活性,但又不会导致细胞的过度死亡,因此我们选用该浓度的Liq进行后续研究。该浓度的Liq与不同浓度的TMZ(25、50、100、200、400和800μM)联合使用后,可以显著增加TMZ对U138增殖的抑制作用。当100μM TMZ与80μM的Liq联合处理72h后,U138肿瘤细胞存活率仅为50.36%,显著低于单独使用TMZ时肿瘤细胞的存活率(90.33%,P<0.001),证明Liq可有效增强肿瘤细胞对TMZ的敏感性。流式细胞术细胞周期分析结果显示,与TMZ单独使用相比,联合使用Liq可进一步增强TMZ诱导的S期阻滞(64.63%vs 40.43%,P<0.001),有效地抑制细胞进入增殖期。Annexin V/PI双染凋亡分析表明Liq和TMZ联合使用可以显著增加U138胶质瘤细胞凋亡率(27.5%vs 18.6%,P<0.001),增加凋亡标志物Caspase-3剪切体的形成。Liq与TMZ的协同作用在另外两种胶质瘤细胞U251和T98G中也得到了验证。Western Blot检测PI3K/AKT/m TOR通路的结果表明,Liq可以激活ERβ,降低AKT和P70S6K磷酸化水平,从而抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路的活性,但对肿瘤耐药基因MGMT并没有直接的影响。通过RNA干扰沉默ERβ表达后,Liq丧失了对PI3K/AKT/m TOR通路的调控作用,说明Liq是通过激活ERβ来调节PI3K/AKT/m TOR通路活性的。PI3K/AKT/m TOR通路的抑制剂XL765可以明显提高细胞对TMZ的敏感性,提示PI3K/AKT/m TOR通路的激活对神经胶质瘤细胞具有保护作用,从而拮抗TMZ的作用。联合使用PI3K/AKT/m TOR激活剂IGF-1可以拮抗Liq介导的TMZ毒性,提示Liq是通过抑制PI3K/AKT/m TOR来发挥作用的。二、体内实验:结果显示,对照组肿瘤平均体积为1.84±0.13cm3,单独使用TMZ组肿瘤平均体积为0.93±0.11cm3,单独使用Liq组肿瘤平均体积为1.34±0.15cm3,而联合使用TMZ和Liq组肿瘤平均体积为0.36±0.04cm3。此结果与体外细胞实验结果相符,联合应用Liq和TMZ可以显著抑制肿瘤生长,提高肿瘤对TMZ的敏感性,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,Western Blot结果证明,Liq可以在体内增加肿瘤细胞ERβ的表达量,推断Liq可能在体内通过激活ERβ及相关信号通路来达到抑制肿瘤生长,提高肿瘤细胞对TMZ敏感性的作用。实验结论:1.Liq可抑制胶质瘤细胞(U138)增殖并明显促进其凋亡,可显著增强肿瘤细胞对TMZ的敏感性;2.Liq通过特异性激活ERβ来抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路的活性;3.Liq对TMZ的增敏功能依赖于其对PI3K/AKT/m TOR通路的抑制;4.体内联合使用Liq和TMZ处理荷瘤小鼠发现Liq显著增加肿瘤细胞对TMZ的敏感性。以上实验结果提示Liq通过激活ERβ抑制PI3K/AKT/m TOR来促进TMZ治疗胶质瘤的效应。同时本研究也为其他ERβ激动剂可以作为一种有效的化疗药物用于神经胶质瘤的常规联合治疗提供了依据和线索。