目的：肝癌低氧微环境(Hypoxia)是肝癌发展过程中的重要阶段,将导致肝癌细胞对化疗药物敏感性降低,逃避凋亡,发生侵袭和转移。但是低氧介导肝癌恶性化过程的分子机制并未完全阐明,因此探索肝癌低氧微环境下促使肿瘤细胞恶性化进程的分子生物学事件以及参与的重要信号通路,对于进一步了解低氧生物学特征,挖掘发挥关键作用的分子,并进而寻找可实现干预低氧肿瘤恶性化的新型治疗靶点具有重要意义。我们的前期研究发现低氧能够激活细胞内的致癌因子Yes-associated protein (YAP蛋白),而YAP蛋白在肝癌的发生发展过程中发挥着关键作用。因此,本课题旨在深入研究低氧微环境激活YAP蛋白的作用方式,进一步探索其激活机制和信号通路,并寻找阻断低氧激活YAP蛋白的小分子化合物,进一步寻求通过干扰YAP蛋白逆转低氧肝癌细胞对化疗药物不敏感性的可行性,为受到低氧影响的肝癌治疗提供新的思路和实验依据。方法：1)采用人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,以及HepG2裸小鼠移植瘤模型,确证肝癌低氧微环境能够诱导肝癌细胞中的YAP蛋白发生核转位、增加YAP蛋白的转录反应活性；考察低氧维持YAP蛋白稳定性的作用.(1)采用人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,以汇合接种的方式(25～30×104cells per 1 mL culture medium,接种36h后细胞长至汇合)分别在常氧条件(20%02)和低氧条件下(1%O2)培养24小时,采用免疫荧光实验观察YAP蛋白在肝癌细胞内的核内外分布,并作计数统计。(2)采用人肝癌细胞HepG2,用上述的接种方式和培养条件培养细胞,收集细胞,采用细胞核质分离实验并结合Western Blot法观察常氧和低氧条件下肝癌细胞核内的YAP蛋白含量。(3)采用人肝癌细胞HepG2,用上述的接种方式和培养条件培养细胞,另外用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)沉默低氧下的YAP,用Trizol法提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,采用Real-time PCR检测细胞中YAP及其靶基因CTGF、AREG的mRNA水平变化。(4)采用HepG2裸小鼠移植瘤模型(瘤体积300～400 mm3),腹腔注射低氧探针PMO用以指示瘤内低氧区域,结合组织冰冻切片技术和免疫荧光实验,观察瘤内低氧对YAP蛋白表达和细胞内分布的影响。(5)采用Western Blot法检测在常氧和低氧条件下YAP蛋白表达随培养时间的变化,并对蛋白条带作灰度分析。(6)采用Western Blot法检测YAP蛋白在常氧和低氧条件下的磷酸化水平变化。(7)采用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)阻断细胞内的蛋白合成,结合Western Blot法检测YAP蛋白在常氧和低氧条件下的降解速率差异。2)采用人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,考察低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对低氧激活YAP蛋白的影响；深入探索低氧激活YAP蛋白的分子机制；并由此寻找阻断低氧激活YAP的小分子化合物。(1)采用HIF-1累积剂二氯化钻(CoCl2)在常氧下孵育三株肝癌细胞HepG2, SMMC-7721和Bel-7402,用免疫荧光实验观察YAP蛋白在肝癌细胞内的核内外分布,并作计数统计。(2) CoCl2累积HIF-1之后,采用Western Blot法检测YAP总蛋白及其磷酸化水平的变化。(3)转染HIF-1α质粒高表达HIF-1α后,采用Western Blot法检测YAP总蛋白变化。(4)用siRNA沉默低氧下的HIF-1α,采用免疫荧光实验观察YAP蛋白的核内外分布、用Western Blot法检测YAP总蛋白变化。(5)用蛋白酶体抑制剂MG132阻断YAP蛋白的泛素化途径降解,结合免疫共沉淀实验和Western Blot法检测YAP蛋白在常氧、低氧和CoCl2刺激下YAP泛素化水平的变化。(6)采用Western Blot法检测YAP蛋白的上游激酶MST激酶和LATS1激酶及其磷酸化在常氧、低氧和CoCl2刺激下的变化。(7)采用Real-time PCR和Western Blot法检测YAP的上游信号HMGCR的mRNA水平和蛋白变化。(8)用siRNA沉默低氧下的HMGCR以及加入甲羟戊酸(mevalonic acid, MVA),采用免疫荧光实验观察YAP蛋白的核内外分布、用Western Blot法检测YAP总蛋白变化。(9)在低氧下加入HMGCR抑制剂他汀类化合物(statins)普伐他汀和阿托伐他汀以及MVA,采用免疫荧光实验观察YAP蛋白的核内外分布、用Western Blot法检测YAP总蛋白变化。(10)在低氧下加入阿托伐他汀,采用细胞核质分离实验并结合Western Blot法观察低氧下肝癌细胞核内的YAP蛋白含量。(11)在低氧下加入普伐他汀和阿托伐他汀以及MVA,采用Real-time PCR检测细胞中YAP靶基因CTGF、ABEG的mRNA水平变化。(12)在低氧下加入普伐他汀和阿托伐他汀,采用Western Blot法检测YAP蛋白的上游激酶LATS1激酶及其磷酸化的变化。3)采用人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,利用siRNA或statins干扰低氧下的YAP蛋白,增加肝癌细胞在低氧下抗肿瘤化合物的敏感性,并对其中的机制进行初步地探索。(1)采用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白,并结合SRB染色法测定不同浓度的索拉非尼(sorafenib)、伊立替康的活性代谢物SN38在低氧下对三株人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402的增殖抑制率的变化,并计算IC50值。(2)采用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白,并结合SRB染色法测定不同浓度的多柔比星(Doxorubicin)、顺铂(Cisplatin)和4-HPR在低氧下对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制率的变化,并计算IC50值。(3)采用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白,加入sorafenib或SN38,采用PI单染结合流式细胞术检测HepG2细胞的凋亡发生率。(4)采用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白,加入sorafenib或SN38,采用Western Blot法检测细胞凋亡标记物PARP的裂解片段。(5)在低氧下分别将阿托伐他汀和普伐他汀与sorafenib或SN38合用,采用SRB染色法测定sorafenib或SN38对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制率的变化,并计算IC50值。结果：1)肝癌低氧微环境能够诱导肝癌细胞内的YAP蛋白发生核转位与激活,并且通过减少YAP蛋白的降解从而维持YAP蛋白稳定.免疫荧光实验结果显示,在低氧下培养三株人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,与常氧对照组相比,低氧能够显著地诱导细胞内的YAP蛋白发生核转位；细胞核质分离实验结合Western Blot发现,低氧条件下的HepG2细胞核内存在大量YAP蛋白。同时,Real-time PCR结果显示,低氧使得YAP靶基因CTGF和AREG的mRNA水平明显上调,通过siRNA沉默低氧下的YAP能够相应地减少CTGF和AREG的mRNA水平。移植瘤组织切片的免疫荧光实验显示,YAP蛋白在肝癌移植瘤内的低氧区域中发生核定位并且呈现高表达。同时,Western blot实验发现常氧下的YAP蛋白随着培养时间延长逐渐减少,而低氧下的YAP蛋白维持相对稳定的蛋白量。YAP的mRNA水平在低氧下没有发生明显变化,Western Blot结果显示,低氧能够使得YAP蛋白Ser127磷酸化减少,加入蛋白合成抑制剂CHX之后,我们发现,与常氧相比,低氧下的YAP蛋白降解更慢。2)低氧微环境诱导肝癌细胞内的YAP蛋白入核与稳定是HIF-1α非依赖的,低氧主要是通过HMGCR/mevalonate-LATS1相关途径发挥激活YAP蛋白的作用；HMGCR抑制剂statins能够阻断低氧激活YAP蛋白.免疫荧光实验发现,HIF-1累积剂二氯化钴(CoCl2)(150μM)在常氧条件下分别孵育三株肝癌细胞HepG2, Bel-7402和SMMC-7721,并不能像低氧那样诱导YAP蛋白入核。Western Blot结果显示,常氧下CoCl2累积起来的HIF-1α虽然可以减少YAP的磷酸化水平,但是其对YAP总蛋白却不表现出和低氧微环境类似的稳定作用；CoCl2处理组细胞的YAP总蛋白水平甚至比常氧对照组的更低。转染HIF-1α质粒高表达HIF-1α蛋白后,得到了类似的结果。用siRNA在低氧下沉默了HIF-1α,免疫荧光实验和Western Blot结果显示,HepG2细胞中的HIF-1α被敲低后,低氧微环境仍可诱导YAP蛋白入核。缺失HIF-1α时,低氧仍然诱导YAP蛋白磷酸化减少,而总蛋白维持稳定。MG132阻断泛素化的YAP被降解,结合免疫共沉淀实验和Western Blot法发现,YAP在低氧下的泛素化明显低于常氧组,而CoCl2刺激之后,YAP的泛素化水平并未减少,甚至还有些增加。Western Blot实验结果显示,YAP蛋白的上游激酶MST及其磷酸化状态在常氧、低氧以及CoCl2刺激下,并没有发生变化；但是,LATS1激酶的活性形式磷酸化LATS1在低氧条件下急剧减少,而在常氧和CoCl2刺激下,LATS1激酶维持较高的磷酸化水平。Real-time PCR实验发现,与常氧对照组相比,YAP的上游信号HMGCR在低氧下的转录水平显著上调。沉默HMGCR之后,免疫荧光实验发现低氧诱导的YAP蛋白核转位被抑制,Western Blot实验发现低氧下累积的YAP总蛋白明显减少,这些效应可以被甲羟戊酸(MVA)。用阿托伐他汀和普伐他汀作用于低氧的HepG2肝癌细胞,免疫荧光实验结果显示,statins能够阻断低氧诱导的YAP蛋白核转位,这一效应可被MVA所逆转。细胞核质分离实验结合Western Blot实验表明,阿托伐他汀在低氧下确实能够抑制YAP蛋白的核内分布。Western Blot实验结果显示,statins作用后,低氧下的YAP总蛋白明显减少。RT-PCR实验发现,在低氧下用statins处理肝癌细胞能够相应地减少低氧下YAP靶基因CTGF、AREG的转录水平,并且是MVA依赖的。Western Blot实验发现,statins能够逆转低氧对LATS1激酶的抑制,增加LATS1的磷酸化。3)在低氧下用siRNA沉默YAP,可以通过诱发细胞凋亡增加抗肿瘤化合物对肝癌细胞的抑制率；statins可以增加肝癌细胞在低氧下对抗肿瘤化合物的敏感性。细胞增殖抑制实验结合SRB染色法发现,在低氧下,不同浓度的sorafenib或SN38对三株肝癌细胞的抑制率与常氧相比,明显减小；用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白后,能够增加sorafenib或SN38对它们的抑制率。在HepG2细胞上,在低氧下不同浓度的多柔比星(Doxorubicin)、顺铂(Cisplatin)以及4-HPR的抑制率均比常氧减小,通过沉默YAP能够增加HepG2对它们的敏感性。PI单染结合流式细胞术实验发现,与常氧相比,抗肿瘤化合物sorafenib或SN38在低氧下诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的发生率减少；用siRNA沉默低氧下的YAP,能够增加低氧下抗肿瘤化合物sorafenib或SN38诱导凋亡的能力。Western Blot结果发现,常氧下用10 μM sorafenib或0.25μM SN38作用于HepG2细胞后,细胞凋亡的标记物PARP裂解片段明显增加；而在低氧下10 μM sorafenib或0.25 μM SN38并不能显著引起PARP的裂解,但是sorafenib或SN38处理的同时沉默YAP,可以增加PARP的切割。细胞增殖抑制实验结合SRB染色法发现,低氧下合用statins能够增加sorafenib或SN38对人肝癌细胞HepG2的抑制率。结论：本课题揭示了肝癌低氧微环境能够通过HMGCR/mevalonate-LATS 1相关途径通过促进核转位激活致癌因子YAP蛋白,并且维持YAP的蛋白稳定性,这一诱导过程不依赖于HIF-1α的功能。statins作为HMGCR抑制剂可有效地阻断低氧激活YAP蛋白,并且下调YAP总蛋白水平。此外,采用siRNA干扰低氧下的YAP蛋白可以通过诱发细胞凋亡从而增加肝癌细胞在低氧下对抗肿瘤化合物的敏感性。在低氧下将statins与sorafenib或SN38合用也能够有效地增加HepG2肝癌细胞对sorafenib或SN38的敏感性。本研究提示YAP有望成为肝癌低氧干预和治疗的新靶点,为肝癌治疗方案的开发和策略选择提供新的思路和理论基础。