论文部分内容阅读
恶性肿瘤是全世界死亡的主要原因之一。胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和致死率位居前列。柠檬苦素类化合物是一类具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等广泛药理活性的化合物,主要存在于芸香科和楝科植物的瓜、果核、皮中。Odoratol是一种柠檬苦素类似物,来源于南美香椿、吴茱萸等植物。前期研究证实,柠檬苦素类似物Odoratol对乳腺腺癌(MCF-7)、非小细胞肺癌(NCI-H460)和黑色素瘤(A375-C5)的肿瘤细胞均有细胞毒性作用,作用机制主要通过抑制细胞增殖而不是凋亡。基于此,我们在药物的筛选和预实验后,开展了柠檬苦素类似物Odoratol对胃癌的作用及潜在机制研究。体外研究中,将人胃癌MKN45细胞分组:①溶媒对照组,无任何处理;②低浓度给药组(8 μM);③中浓度给药组(16 μM);④高浓度给药组(32μM):⑤高浓度给药组加抑制剂一组(32 μM+NAC);⑥高浓度给药加抑制剂二组(32μM+U0126);柠檬苦素类似物Odoratol溶解于DMSO中,给药组中按照浓度低高依次加入Odoratol并使终浓度达到8 μM、16 μM和32 μM,第五组中同时加入32 的柠檬苦素类似物Odoratol和10 mmol/L的抗氧化剂(ROS清除剂)NAC,第六组中加入32μM的柠檬苦素类似物Odoratol和0.07 μM的抑制剂U0126。MTT实验证实,柠檬苦素类似物Odoratol可以抑制MKN45细胞增殖。然而,Annexin-V PI双染证实Odoratol不能引起MKN45细胞凋亡,因此这引发了我们对其诱导其它死亡方式或者其它药效的研究。进一步的实验证实,Odoratol诱导MKN45细胞明显过量的活性氧(ROS)积累。Transwell和划痕实验证明,odoratol抑制MKN45细胞的侵袭和迁移能力。此外,自噬相关蛋白Beclin-1,Atg5,Atg7表达上调。在odoratol暴露下,轻链3(LC3)-Ⅰ蛋白质转化为LC3-Ⅱ。透射电镜检测证实,Odoratol给药导致自噬体的形成。免疫荧光试验表明,Odoratol给药引起荧光蛋白LC3的点形成。机制实验中,Western blot结果显示,ROS/丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在odoratol活性的内在机制中起着重要的作用。N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)或U0126使用后,能引起自噬、侵袭、转移的相关药效改变,N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)或U0126的使用验证了ROS/MEK/ERK信号传导途径的调节作用。体内研究中,本研究采用了MKN45裸鼠移植瘤模型来检测柠檬苦素类似物Odoratol在体内的抗胃癌增殖作用。将MKN45注射至裸鼠体内,建立MKN45移植瘤模型,待裸鼠体内MKN45移植瘤长到100 mm3时,将30只裸鼠随机分为6组:(1)对照组;(2)低剂量药物组;(3)中剂量给药组;(4)高剂量给药组;(5)阳性药组(5-FU);柠檬苦素类似物Odoratol尾静脉注射给药,每日一次:低剂量组:12 mg/kg;中剂量组:24 mg/kg;高剂量组:48 mg/kg;对照组给予相同剂量的5%DMSO的无菌生理盐水。阳性药组给予抗肿瘤药物5-FU皮下注射,10 mg/kg,两日一次。实验证实,MKN45移植瘤建立成功,裸鼠未有异常现象。柠檬苦素类似物Odoratol给药后,裸鼠未有呕吐、颤抖、死亡等中毒反应,各组裸鼠体重在实验期间没有差异,而MKN45移植瘤瘤体减小,特别是中、高剂量组抑瘤明显。Ki67免疫组化染色证实,柠檬苦素类似物Odoratol可以降低瘤体细胞增殖。综上所述,本实验证实,柠檬苦素类似物Odoratol可以抑制MKN45细胞体内外增殖,同时,抑制MKN45细胞体外侵袭、转移,可以诱导MKN45细胞自噬水平的升高。自噬在柠檬苦素类似物Odoratol对抗MKN45细胞增殖中起了重要的作用,ROS的生成是柠檬苦素类似物Odoratol产生药理作用的重要基础。而MAPK信号通路之一MEK-ERK信号通路,则介导了柠檬苦素类似物Odoratol调控MKN45胃癌细胞自噬、侵袭、转移的相关药理作用。因此,本研究提出柠檬苦素类似物Odoratol可能进一步发展成用于胃癌临床治疗的抗肿瘤剂。