目的:　　肺癌是严重威胁人类健康的一种临床常见的恶性肿瘤。研究发现，绝大多数肿瘤组织内存在有不同程度的乏氧细胞，而乏氧细胞对放射线是抗拒的，这也是造成肿瘤放疗失败和复发的根源。缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1alpha，HIF-1α）是目前备受关注的一种氧调节因子，组织或细胞的氧浓度降低会诱导该基因高表达，进而增加肿瘤的恶性表型。榄香烯是从中药莪术中提取的抗癌药物，β-榄香烯是其主要活性成分，目前研究表明β-榄香烯能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成等。但是，榄香烯对乏氧状态下肺腺癌细胞凋亡及相关机制，研究报道甚少。本研究旨在探索β-榄香烯是否通过调节HIF-1α的表达活性而发挥其抗癌的作用及相关机制。　　方法:　　一、细胞培养　　人肺癌细胞系A549于RPMI1640培养基中加入10％的胎牛血清，青霉素(1×105U/L)，链霉素(100mg/L)加入到培养基中。培养条件为37℃，95％空气和5％CO2的细胞培养箱，每2～3d换液或传代一次。预处理前1％低氧培养30min，之后正常氧含量常规培养。　　二、细胞增殖率测定　　培养好的A549细胞进行细胞接种（96/孔培养板），加入榄香烯，浓度选择为:0，10，20，40，80，160μg/ml，加入榄香烯后细胞培养0，24，48和72h。在各个时间点，培养细胞每孔加MTT10μl，在细胞与MTT液作用4h后，吸管洗净培养液，孔中加入DMSO150μl，于摇床上振荡10min，在充分混匀溶解后，使用酶标仪测量吸光度值(OD)（490nm波长）。　　三、流式细胞术双染检测细胞凋亡率　　各组细胞传代培养24小时后，胰酶消化法收集细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞三次。用含有10μl Annexinv/PI2∶1的结合缓冲液共500μl重悬细胞。混匀后，避光冰上放置30min。采用流式细胞仪进行检测，软件分析细胞凋亡率。　　四、TUNEL法检测细胞凋亡　　A549细胞以4×104/ml接种于12孔板;4％多聚甲醛室温固定10min;孔板中滴加50μl Cytonin孵育30min（室温），采用3％H2O2新鲜配置DNase-free水洗2次（室温5min），后PBS洗1min;TdT标记缓冲液室温孵育5min;每张切片滴加50μl标记反应混和液，室温作用1h，TdT终止缓冲液室温作用5min，PBS洗2次;加入50μl Streptavidin-HRP Detection Solution室温孵育20min，PBS洗2次;FITC显色。　　五、细胞转染　　将含有HIF-1α基因的pHIF-1α/EGFP-C2质粒与p-EGFP-C2空质粒转染A549细胞。细胞以10×104的密度铺24孔板。根据质粒的质量体积比，按照Lipofectamine2000转染说明进行转染操作。利用western-blot方法检测转染效率。　　六、免疫荧光方法检测各组A549细胞HIF-1α蛋白的表达　　细胞接种（24孔板），采用多聚甲醛固定细胞（室温，1h）。加入HIF-1α抗体(1∶200)冰箱冷藏孵育过夜（4℃条件下）。细胞用PBS冲洗3次，暗室条件下加入FITC标记的二抗，孵育1小时，加入DAPI(1∶100)染核，PBS冲洗3次，荧光显微镜下观察、拍照。　　七、Western印迹法检测Bax、Bcl-xl、caspase3及HIF1-α蛋白表达细胞提取蛋白，收集蛋白样品后测定蛋白样品的浓度，将样品加入到SDS-PAGE加样孔内以恒压80v跑电泳90-120分钟，电泳后转到PVDF膜上，采用恒流300mA转膜2小时，封闭两小时后，分别加入兔抗人Anti-Bax(1∶400)，anti-Cleaved-caspase3(1∶400),anti-pro-caspase3(1∶400),anti-Bcl-xL(1∶400),anti-HIF1-α(1∶400)，anti-β-actin(1∶800)。4℃过夜，洗膜，分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶1500)，室温孵育120分，洗膜，ECL发光法显影，扫描仪成像，自动成像系统分析。　　八、统计学处理及结果分析　　实验数据采用X±SEM，用SPSS18.0软件包对上述各项指标的变化均进行组内和组间比较分析，组间多重比较采用Tukeys方法。P＜0.05具有统计学意义。　　结果:　　一、β-榄香烯对细胞增殖能力和凋亡的影响　　结果显示，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml or160μg/ml的β-榄香烯作用24，48and72小时对A549细胞增殖具有显著的抑制作用，呈时间，剂量依赖性。　　凋亡检测结果显示，与对照组相比，乏氧组，10μg/mlβ-榄香烯/乏氧组以及20μg/mlβ-榄香烯/乏氧组的细胞的凋亡率均明显增加。与乏氧组相比，10μg/mlβ-榄香烯/乏氧组以及20μg/mlβ-榄香烯/乏氧组的细胞凋亡率均明显增加。　　二、β-榄香烯对HIF-1α蛋白表达的影响　　免疫荧光结果显示，对照组、20μg/mlβ-榄香烯组的细胞内存在的少量HIF-1α的表达，而乏氧组HIF-1α的表达明显有增高。与乏氧组相比，10μg/mlβ-榄香烯/乏氧组和20μg/mlβ-榄香烯/乏氧组的HIF-1α免疫荧光表达均明显降低。Western-blot结果与免疫荧光结果趋势一致。　　三、β-榄香烯对细胞凋亡相关蛋白表达的影响　　Western-Blot结果显示，与对照组相比，乏氧组和β-榄香烯乏氧组Bax和caspase-3的蛋白表达升高，而抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达下降。与乏氧组相比，β-榄香烯/乏氧组Bax和caspase-3蛋白表达升高，Bcl-xL的表达下降。TUNEL结果提示，与对照组相比，乏氧组和β-榄香烯乏氧组TUNEL阳性细胞增多。与乏氧组相比，β-榄香烯/乏氧组TUNEL阳性细胞增多。提示β-榄香烯可以促进乏氧状态下的肺癌A549细胞凋亡。　　四、HIF-1α基因转染鉴定　　结果显示，与未转染的对照组相比，转染pHIF-1α/EGFP-C2质粒后，细胞表达HIF-1α蛋白明显增加。　　五、HIF-1α过表达对A549细胞凋亡的影响　　结果提示，与对照组相比，乏氧组细胞凋亡增加。20μg/mlβ-榄香烯/乏氧组细胞凋亡进一步增多。与20μg/mlβ-榄香烯/乏氧组相比，20μg/mlβ-榄香烯组/乏氧/pHIF-1α转染组的凋亡降低。我们还利用western blot方法进一步明确各组别的凋亡相关蛋白的表达情况。与对照组相比，乏氧组凋亡相关蛋白表达增加。20μg/mlβ-榄香烯/乏氧组细胞凋亡相关蛋白表达进一步增多。而20μg/mlβ-榄香烯组/乏氧/pHIF-1α转染组的凋亡相关蛋白表达均降低。　　结论:　　1、β-榄香烯可以诱导缺氧条件下A549细胞凋亡。2、β-榄香烯可以上调乏氧状态下A549细胞的Bax、caspase-3蛋白表达，降低Bcl-xL表达。3、β-榄香烯可以诱导缺氧条件下A549细胞凋亡其作用机制可能是通过抑制HIF-1α的高表达而实现的。