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第一章:Corin在肾极性上皮细胞中顶端特异性表达的分子机制研究研究目的:Ⅱ型跨膜丝氧氨酸蛋白酶（Type Ⅱ transmembrane serine proteases,TTSPs）是一类锚定在细胞膜上的蛋白酶,参与多种生理功能的调节。心房利钠肽（atrial natriuretic peptide,ANP）转化酶corin是一种在细胞膜上活化的蛋白酶,参与调节血压与水钠平衡。Corin不仅在心脏中表达,也在皮肤、骨骼、妊娠子宫以及肾脏等组织中表达。动物模型与临床研究表明,corin在肾脏中具有重要作用。前期的研究发现,肾脏中的corin主要表达在重吸收的主要场所近曲小管上皮细胞中,且特异性地表达在近曲小管上皮细胞的顶端膜上,提示corin在近曲小管上皮细胞中顶端特异性表达对于肾脏中水钠平衡的调节具有重要作用。但迄今为止,corin在近曲小管上皮细胞（极性上皮细胞）顶端膜表达的分子机制尚不清楚。在本章节中,我们将通过检测人肾脏组织样本,研究corin在近曲小管上皮细胞中的亚细胞定位;并以犬肾小管上皮细胞（Madin-Darby Canine Kidney,MDCK）为肾极性上皮细胞模型,研究corin在肾极性上皮细胞中顶端特异性表达的分子机制。研究方法:1.运用免疫电镜检测corin蛋白在人肾近曲小管上皮细胞中的亚细胞定位;2.以MDCK细胞为极性上皮细胞模型,运用细胞转染、免疫荧光技术以及共聚焦显微镜检测corin在MDCK细胞中的表达;3.以人野生型corin质粒为模板,通过ClonExpress（?）One Step Cloning试剂盒构建一系列corin突变体及TMPRSS3/4等表达质粒;4.运用免疫荧光技术检测corin突变体及TMPRSS3/4、enterokinase（EK）、hepsin等在MDCK细胞中的膜表达分布;5.运用SWISS-MODEL和PyMoL软件建立corin和其他蛋白低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor domain,LDLR）结构域的同源模型。结果:1.免疫电镜的结果显示,corin仅表达在人肾近曲小管上皮细胞刷状缘底侧的顶端膜区域,而在基底侧膜上未见表达;2.将人野生型corin质粒转染MDCK细胞后,通过免疫荧光技术与共聚焦显微镜检测发现,corin特异性地表达在MDCK细胞的顶端膜上,而在基底侧膜上未见表达;3.运用免疫荧光技术检测corin结构域缺失的突变体蛋白在MDCK细胞中的表达。结果显示,LDLR8或清道夫受体（scavenger receptor,SR）结构域缺失的corin突变体蛋白在MDCK细胞的顶端和基底侧膜上均有表达,而其他结构域缺失的突变体依然特异性地表达在顶端膜上;4.免疫荧光技术检测具有LDLR或SR结构域的hespin、TMPRSS3、TMPRSS4和EK在MDCK细胞中的表达,发现EK特异性地表达在MDCK细胞的顶端膜上,而hepisn、TMPRSS3和TMPRSS4在细胞的顶端和基底侧膜上均有表达;5.免疫荧光技术检测EK-△LDLR2和EK-△SR在MDCK细胞中的表达,发现EK-△LDLR2和EK-△SR均可特异性地表达在MDCK细胞的顶端膜上;6.运用 ClonExpress（?）One Step Cloning 试剂盒将 hepsin-SR 结构域替换corin-SR结构域制成突变体HSRCorin和corin-LDLR6替换LDLR8制成突变体R6Corin,并通过免疫荧光技术检测上述突变体在MDCK细胞中的表达情况。结果表明,HSRCorin可特异性表达在MDCK细胞的顶端膜上,而R6Corin则在细胞的顶端膜和基底侧膜均有表达;7.运用位点特异性突变技术构建corin-LDLR8结构域中“DSSDE”基序（motif）缺失的突变,并通过免疫荧光技术进行检测。结果显示,“DSSDE”基序缺失使得corin蛋白在MDCK细胞的顶端膜和基底侧膜均有表达;8.运用位点特异性突变技术将corin-LDLR8结构域中“DSSDE”基序分别转移到LDLR6和LDLR7结构域上制成突变体ML6/S684A和ML7/S684A。免疫荧光的结果显示,ML6/S684A和ML7/S684A均可表达在MDCK细胞的顶端膜上。9.计算机模拟建立的蛋白质结构模型中,corin-LDLR8结构域的“DSSDE”基序位于蛋白结构的拐角位置,且“DSSDE”基序中的第一个Ser（S）残基暴露在表面,具有与其他蛋白质相互作用的潜力。结论:我们的结果表明,corin蛋白特异性地表达在人肾近曲小管上皮细胞和MDCK细胞的顶端膜上,并且LDLR8结构域上的“DSSDE”基序是corin顶端特异性表达的关键元件。第二章:“DSSDE”基序在CD320蛋白顶端特异性表达中的作用研究目的:第一章的研究结果显示corin-LDLR8结构域上“DSSDE”基序是corin顶端特异性表达的关键元件。细胞表面的许多受体和蛋白水解酶中的LDLR结构域中均存在保守的“D×SDE”基序（“×”为任意氨基酸）。CD320是一种肾脏表达的转钴铵素受体,具有两个LDLR结构域,其中第二个LDLR（LDLR2）结构域中存在“DSSDE”基序。在本章节中,我们将探究CD320在人肾近曲小管上皮细胞中的表达分布情况,并同样以MDCK细胞为肾极性上皮细胞模型,探究LDLR2结构域中的“DSSDE”基序是否也在CD320顶端特异性表达中发挥作用。研究方法:1.运用组织免疫荧光技术检测CD320与corin蛋白在人肾近曲小管上皮细胞中分布;2.以MDCK细胞为极性上皮细胞模型,运用免疫荧光技术检测CD320与corin蛋白在MDCK细胞膜上的表达;3.通过SWISS-MODEL软件模拟建立CD320-LDLRs结构域蛋白结构模型,并通过PyMoL软件生成最终的结构模型图;4.通过位点特异性突变技术构建CD320系列突变体,并运用免疫荧光技术检测其在MDCK细胞膜上的表达。结果:1.组织免疫荧光技术检测的结果显示,CD320蛋白表达在肾近曲小管上皮细胞刷状缘底侧的顶端膜上,并且与corin蛋白表达的位置重叠;2.细胞免疫荧光技术检测的结果显示,与corin相同,CD320蛋白特异性地表达在MDCK细胞的顶端膜上,而在细胞的基底侧膜上未见表达;3.在计算机建立的模型中,CD320-LDLR2结构域呈现出与corin-LDLR8结构域相似的拓扑结构,“DSSDE”基序处于相似的拐角处;4.通过免疫荧光技术检测CD320-LDLR2结构域中的“DSSDE”基序缺失的突变体在MDCK细胞中的表达,结果显示,“DSSDE”基序缺失导致CD320在MDCK细胞的顶端与基底侧膜上均有表达;5.通过位点特异性突变技术将CD320-LDLR2结构域上的“DSSDE”基序转移到LDLR1结构域上制成突变体ML1/S162A,并通过免疫荧光检测发现,ML1/S162A特异性地表达在MDCK细胞的顶端膜上。结论:人CD320在肾极性上皮细胞中表现出与corin相似的特异性顶端表达模式。CD320-LDLR2结构域上同样包含一个保守的“DSSDE”基序,该基序也是CD320在MDCK细胞中顶端特异性表达的关键元件。以上结果提示,在肾极性上皮细胞中,LDLR结构域上存在的“DSSDE”基序可能也在其他顶端表达蛋白中发挥类似的作用。第三章:Rab11a在corin与CD320顶端特异性表达中的作用研究目的:在第一、二章的结果中,我们发现LDLR结构域上的“DSSDE”基序参与corin和CD320在肾极性上皮细胞中的顶端特异性表达过程。然而,蛋白在极性细胞中的极性表达过程并非单因素决定的,而是胞内多分子相互作用的结果。Rab蛋白是一类小分子GTP酶蛋白,分布于细胞循环内体中,且在细胞内囊泡转运和细胞膜靶向运输过程中发挥重要作用。其中Rabll（包括Rablla与Rab11b两种亚型）参与极性上皮细胞中顶端囊泡的转运过程。本章节中,我们将在肾极性上皮细胞中研究Rab11在corin和CD320顶端特异性表达中的作用。研究方法:1.通过 ClonExpress（?）One Step Cloning 试剂盒构建 Rab11a、Rabllb 及其功能缺失突变体DNRab11a和DNRab11b的表达质粒;2.将 corin 分别与 Rab11a、Rab11b、DNRablla 和 DNRab11b 共转染 MDCK细胞,并通过免疫荧光技术检测上述蛋白对corin在MDCK细胞中顶端特异性表达的影响;3.建立稳定shRNA靶向抑制内源性Rab11a表达的MDCK细胞系:shRab11a1和shRablla2,并运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测Rab11a基因表达水平;4.免疫荧光技术检测corin与CD320蛋白在shRab11a1和shRab11a2细胞系中的膜表达分布。结果:1.免疫荧光技术检测的结果显示,在corin与DNRablla质粒共转染的MDCK细胞中,corin在细胞的顶端与基底侧膜上均有表达;而在corin分别与Rab11a、Rab11b和DNRab11b等质粒共转染的MDCK细胞中,corin仅表达在细胞的顶端膜上;2.qRT-PCR 的结果显示,shRab11a1 和 shRab11a2 细胞中Rab11a的mRNA水平相比对照组细胞显著降低;3.将corin和CD320质粒分别转染Rab11a表达降低的MDCK细胞系,运用免疫荧光技术检测发现,corin和CD320均在细胞的顶端膜和基底侧膜上表达。结论:Rab11a参与corin和CD320在肾极性上皮细胞中的顶端特异性表达过程。基于本章和第一、二章中的研究结果,我们提出了一个模型,在肾极性上皮细胞中,corin-LDLR8和CD320-LDLR2结构域中的“DSSDE”基序被Rab11a依赖的细胞内蛋白转运机制所识别,从而允许蛋白向顶端膜靶向运输。第四章:TMPRSS11A活化的生化与细胞学研究研究目的:在前三章的内容中,我们探究了Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶corin在肾脏极性上皮细胞中顶端特异性表达的分子机制。除corin之外,Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族还有16个家族成员,它们参与调节体内多种生理和病理过程,其中的TMPRSS11A主要表达在食管上皮细胞和气道上皮细胞。近期的研究表明,气道上皮表达的TTSPs可通过裂解病毒表面的刺突蛋白（spike,S）蛋白参与冠状病毒感染过程。已有实验表明,TMPRSS11A 可切割活化 SARS（severe acute respiratory syndrome）与 MERS（Middle East respiratory syndrome）病毒表面的 spike 蛋白,促进病毒感染。然而,目前TMPRSS11A活化的分子机制尚不明了。本章节我们将探究TMPRSS11A在细胞中活化的分子机制。在人胚肾上皮细胞HEK293（human embryonic kidney 293）与食管癌细胞 EC9706（Esophageal Cancer 9706）中探究TMPRSS11A的活化方式和活化位置。研究方法:1.通过基因克隆和定点突变技术构建人野生型TMPRSS11A（11A）、其活化切割位点突变体R186A、酶活性位点突变体S368A和可溶性TMPRSS11A（sloluble TMPRSS11A,s11A）等质粒;2.运用蛋白免疫印迹法（Western blotting）、流式细胞术（Flow cytometry）、免疫荧光技术以及生物素标记膜蛋白法（Biotin labeling）检测TMPRSS11A在HEK293中的表达和活化情况;3.将野生型TMPRSS11A和其突变体R186A与S368A分别转染HEK293和EC9706细胞,并运用Western blotting分析上述蛋白在细胞裂解液中的表达与活化情况;4.用糖苷酶PNGase F处理表达TMPRSS11A的细胞裂解液,Western blotting检测TMPRSS11A蛋白的N-糖基化情况;5.为检测TMPRSS11A在细胞中的活化位置,用胰蛋白酶（trypsin）处理表达TMPRSS11A的HEK293细胞,裂解细胞后,运用Western blotting检测细胞裂解液中TMPRSS11A的活化情况;6.为检测丝氨酸蛋白酶抑制剂:肝细胞生长因子激活抑制剂1（hepatocyte growth factor activator inhibitor type-1,HAI-1）和肝细胞生长因子激活抑制剂 2（hepatocyte growth factor activator inhibitor type-2,HAI-2）是否可抑制TMPRSS11A活化,将HAI-1和HAI-2分别与TMPRSS11A共转染HEK293细胞,并运用Western blotting检测TMPRSS11A在细胞裂解液中的活化情况;7.将表达s11A的HEK293 细胞培养上清与 S-ECD（spike protein extracellular domain）蛋白进行孵育,运用Western blotting检测S-ECD蛋白的裂解情况,检测TMPRSS11A是否可切割活化新型冠状病毒spike蛋白。结果:1.Western blotting检测发现,在表达TMPRSS11A的HEK293细胞的裂解液中检测到其活化条带。该结果提示,TMPRSS11A能够在HEK293细胞中发生活化;2.流式细胞术和免疫荧光技术检测的结果显示,TMPRSS11A表达在HEK293细胞的细胞膜上,证实了 TMPRSS11A的膜拓扑结构;3.生物素标记和Western blotting的实验表明,激活的TMPRSS11A分子既存在于细胞裂解液中,也存在于细胞表面;4.在HEK293和EC9706细胞的裂解液中均发现,在转染TMPRSS11A的样品中,可检测到活化条带;而在转染突变体R186A与S368A的样品组中,均未检测到活化条带。该结果表明,TMPRSS11A是通过自我切割的方式活化的;5.Western blotting检测分析trypsin去除膜蛋白后的细胞裂解液,发现依然可检测到TMPRSS11A的活化条带。提示TMPRSS11A在到达细胞膜表面之前就被活化;6.Western blotting检测分析丝氨酸蛋白酶抑制剂与TMPRSS11A质粒共转染的HEK293细胞样品,结果显示,在HAI-1与TMPRSS11A共转染的细胞样品中,相比对照组,TMPRSS11A的活化条带明显减少;在HAI-2与TMPRSS11A共转染的细胞样品中,相比与HAI-1共转的样品组,TMPRSS11A的活化条带减少的更加明显。该结果提示,相比HAI-1,HAI-2对TMPRSS11A的自激活过程具有更强的抑制效果;7.Western blotting检测的结果显示,在s11A与S-ECD蛋白的孵育的样品组中,可检测到S-ECD蛋白裂解产生的S2蛋白片段,而在对照组中未检测到该条带。提示TMPRSS11A可切割活化新型冠状病毒的spike蛋白。结论:我们的结果表明,TMPRSS11A在细胞内发生了自我激活,这种细胞内自激活机制不同于目前已知的TTSPs细胞外活化机制;蛋白酶抑制剂HAI-2可能在调节TMPRSS11A活化中起重要作用;我们还发现TMPRSS11A可切割活化新型冠状病毒spike蛋白。这些发现为TMPRSS11A在上皮细胞中的功能和冠状病毒感染中的潜在作用提供了新的见解。