目的犬传染性肝炎(Infectious canine hepatitis ,ICH)是由犬传染性肝炎病毒(ICHV)引起的一种常见的急性败血性传染病。该病多发生于1岁以内的幼犬,死亡率高达40%,给养犬业造成较大的经济损失。预防本病发生的主要措施就是加强饲养管理,严格兽医卫生措施和定期进行免疫接种。目前,在实验用犬和其他养犬业,主要采取定期接种ICHV弱毒疫苗的方法。除此之外还有,ICH与犬细小病毒性肠炎二联苗和犬五联苗(犬瘟热、细小病毒、传染性肝炎、副流感、冠状病毒)等。1991年Willianms等的实验为DNA疫苗(DNA vaccine)的提出奠定了基础。DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因直接导入动物体细胞内,并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。DNA疫苗亦称为核酸疫苗(nucleic acid vaccine)。作为一种新兴的疫苗,认为核酸疫苗能够在感染性疾病、肿瘤等的预防和治疗方面具有很大的潜力。近年来,得到了广泛关注并获得了迅速发展。目前,美国FDA已经批准了流感、结核、疟疾、艾滋病等数种核酸疫苗进行临床试验。虽然DNA疫苗前景广阔,但目前对其安全性方面还存在尚多的疑虑。主要包括:(1)被注射的DNA有可能被整合到宿主的染色体,并引起插入突变,活化致癌基因;(2)外源抗原的长期表达可能导致不利的后果,理论上的可能性包括免疫耐受、自身性免疫病、过敏反应、自身攻击等;(3) DNA疫苗对生态环境的潜在威胁,主要涉及质粒DNA被摄入机体后是否发生基因残留、传递或转移。这些安全问题是研究核酸疫苗的焦点之一。虽然目前在动物模型研究尚未发现以上副作用,但完全排除理论上可能发生的危险性,尚需更多的实验依据。本室已经构建的抗ICHV核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop,免疫BALB/c小鼠后,诱导出特异性体液免疫和细胞免疫,产生具有杀伤表达病毒抗原靶细胞的CTL效应,显示出良好的免疫原性和免疫反应性。本课题采用本实验室构建的抗犬传染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠,对其安全性进行评价,为犬传染性肝炎核酸疫苗的应用提供依据。方法1质粒提取用碱裂解法提取真核重组质粒阳性克隆重组菌接种于2×YT液体培养基振荡培养36小时;离心收集细菌沉淀。采用SDS-碱裂解法提取重组质粒pVAX1-CpG-Loop,并对提取的重组质粒pVAX1-CpG-Loop进行纯度和浓度测定,免疫前用PBS稀释至所需浓度。2动物免疫112只6-8周龄的雌雄BALB/c小鼠随机分为4组:⑴高剂量组:小鼠右股四头肌注射重组质粒pVAX1-CpG-Loop 200μg,注射体积为100μl;⑵低剂量组:同样采取股四头肌注射,注射剂量100μg,注射体积100μl;⑶联合免疫组:采用肌肉注射100μg/100μl ,皮下注射50μg/50μl ,滴鼻50μg/50μl,;⑷空白对照组:肌肉注射PBS100μl。每两周免疫一次共免疫三次。3免疫动物的安全性评价一般指标观察每天观察并记录受试动物的一般活动及精神状况, ,粪尿颜色及粪便是否成形等,如有死亡,记录死亡数并作解剖观察。每周称量体重1次,计算出每组动物的平均体重,观察体重增长情况。末次免疫后4周测定各组动物的血常规。分别于末次免疫后4周和6个月时,测定受试动物的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。质粒pVAX1-CpG-Loop在小鼠体内的分布及存留时间提取末次免疫后7天、15天、30天动物肝,脾,心,肾,肺,卵巢,睾丸及注射部位肌肉的RNA,反转录后PCR扩增;提取末次免疫后1周,8周,12周动物的肝,脾,心,肾,肺,卵巢,睾丸,注射部位肌肉的DNA,进行PCR扩增。组织病理观察末次免疫后4周和6个月分别取各剂量组动物肝,脾,心,肾,肺,注射部位的肌肉进行石蜡切片、HE染色观察有无组织损伤。对F1代的影响末次免疫后4周,将相同剂量组的雌鼠雄鼠配对,每组7对,观察其受孕情况,幼崽的生长状况。提取出生2周幼崽的肝、脾DNA并进行PCR扩增观察质粒DNA整合情况。结果1一般状况:在受试过程中未发现动物死亡。各实验组与对照组动物活动,精神状态,尿及粪便性状未见明显差异。各受试动物体重增长情况没有明显差异(P>0.05)。受试动物血常规各监测指标在各组间均无明显差异(P>0.05)。末次免疫后4周丙氨酸转氨酶(ALT)在各组动物无明显差别,而高剂量组、低剂量组、联合免疫组的天冬氨酸转氨酶(AST)均显著高于对照组(P<0.05)。末次免疫6个月后各实验组与对照组相比,AST和ALT均无显著差异(P>0.05)。2质粒pVAX1-CpG-Loop在小鼠体内的分布及存留时间受试动物注射pVAX1-CpG-Loop或PBS后,在上述各时间点分别提取各组动物脏器RNA,用RT-PCR的方法检测结果显示:末次免疫第7天各剂量组的肝、脾和肌肉中均有Loop gene的表达,而15天后Loop gene仅在肝和肌肉中表达,30天在所有脏器中均不表达。其它脏器和空白对照组各脏器均无Loop gene的表达。分别于末次免疫第1周,第8周,第12周提取上述各脏器的基因组DNA,用PCR方法扩增Loop gene,第1周高剂量和低剂量组肝、脾、肾、肌肉和联合免疫组肝、脾、肾、肺和肌肉均有Loop gene分布;第8周各剂量组仅在肌肉分布;第12周各脏器均无分布。PBS组各脏器未发现Loop gene的分布。3对F1代影响末次免疫4周后将注射相同剂量的雌鼠雄鼠配对,生产后,计数幼崽的个数,各实验组与空白组没有显著差异(P>0.05)。幼崽生长状况良好,出生时的体重各实验组与空白组没有显著差异(P>0.05)。幼崽出生2周分别提取肝,脾DNA并进行PCR未发现有扩增产物说明质粒没有整合到子代DNA中。4组织病理观察组织病理观察结果表明,末次免疫后4周和6个月各受试动物脾、心、肺、注射部位的肌肉无明显损伤。各剂量组与PBS组相比,末次免疫后4周肝脏均有淋巴细胞等炎细胞浸润,出现水样变性,6个月后上述病变明显减轻;末次免疫后4周各剂量组肾小球有明显淋巴细胞浸润,6个月后炎症明显缓解。结论1一般安全性研究结果表明该DNA疫苗对BALB/c小鼠的健康状况、体重增长和血常规均没有显著影响。2 DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop对生殖及F1代的影响研究,结果表明其对生殖和F1代无明显影响。3末次免疫后12周所有的被检组织均没有扩增出Loop基因,说明DNA疫苗没有整合到宿主基因组中。4 DNA疫苗在小鼠体内的分布表明其在体内的分布与免疫方式(肌肉注射,联合免疫)有关,且不存在于生殖器官。5末次免疫4周血液生化监测表明AST显著升高,ALT无明显变化,6个月后AST和ALT均无显著差异,表明该DNA疫苗对BALB/c小鼠肝脏的损伤是一过性的。6末次免疫后4周组织病理观察结果均显示BALB/c小鼠存在肝和肾损伤,但这种损伤在末次免疫后6个月恢复,表明该DNA疫苗对肝和肾损伤是一过性的。